一种生物探针、检测呋喃唑酮的试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生物探针、检测呋喃唑酮的试纸条及其应用，将纳米金标记的抗呋喃唑酮的抗体作为检测探针，纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G作为增强探针，两种探针同时喷在同一个疏水垫上，随着样品溶液的流动，先后洗脱下来，双探针随即在抗体和二抗的结合下使金聚合在一起，形成复杂的网状结构，后随着毛细管作用向前流动，在T线形成清晰的红色条带，起到信号放大的作用，同时，显著减少抗体的用量，从而引发更激烈的竞争反应，提高灵敏度。

A bioprobe, test paper for the detection of furazolidone and its application

The invention discloses a test strip a biological probe and detection of furazolidone and its application, the nano gold labeled anti furazolidone on the antibody as detection probe, nano gold labeled Goat anti mouse immunoglobulin G as enhanced probe, two probe and spray on the same hydrophobic pad. With the sample solution flow, successively eluted and then in the double probe antibody and two anti binding to gold together, forming a complex network structure, with the capillary flow forward, forming a clear red line in the T line, the signal amplification effect, at the same time, significantly reduce the amount of antibody thus, the competition more intense reaction, improve the sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种生物探针、检测呋喃唑酮的试纸条及其应用
本专利技术属生物检测领域，具体涉及一种生物探针、检测呋喃唑酮的试纸条及其应用。
技术介绍
呋喃唑酮，是硝基呋喃抗生素中最常用的一种(其余主要包括呋喃西林，呋喃它酮和呋喃妥因)，其在体内代谢迅速，半衰期短，母体药物不能稳定存在。然而，呋喃唑酮的代谢产物3-氨基-2-恶唑酮(AOZ)可以与组织中蛋白质紧密结合，以结合态的形式稳定存在于机体内，且残留的时间越长，此类药物产生的毒性越强。由于呋喃唑酮抗生素价格低廉，且对细菌、原虫等病原体和真菌均有杀灭作用，因此被广泛运用于牲畜和水产品中，以治疗和预防由细菌、原生物引起的各种胃肠感染，也作为家畜生长促进剂。但由于其原药及其代谢物对人体有潜在的致癌、致畸副作用，各个国家在牲畜副食品生产过程中已禁止此类药物使用。因此加强对畜产品、水产品及饲料中呋喃唑酮抗生素残留的检测、特别是速测，以便及时了解和掌握食品及饲料的卫生信息，是增强食品安全性的一个重要环节。由于呋喃唑酮在体内代谢很快，因此对其残留状况的分析以其代谢物AOZ为标准，而AOZ作为小分子不能产生免疫反应，则将其衍生物作为检测的目标物。目前检测呋喃唑酮残留常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫试验法(ELISA)，而免疫层析试纸条作为近年来极受关注的新型检测方法，克服了原有方法的缺点，不需要昂贵的实验室仪器和专业的操作人员，具有特异性强、灵敏度高、成本低、对实验人员和环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点，具有极大的应用价值和前景。由于呋喃唑酮代谢物检测所用竞争性免疫层析试纸条要经过复杂的衍生过程和高质量的抗体，因此目前用免疫层析试纸条检测呋喃唑酮的研究很少。目前，存在的用免疫层析试纸条检测呋喃唑酮的研究有：2016年TaoLe,YongXie,LiqianZhu,andLeiZhang小组用量子点标记的抗体作为信号探针检测呋喃唑酮代谢物，其用肉眼观察的检测线大于10μg/L。2017年，该小组用胶体金标记的抗体作为信号探针检测呋喃唑酮代谢物，其可视化的检测线为10μg/L。近年来，有研究致力于替换标记物来提高检测灵敏度，但新型的标记材料(荧光微球、量子点、磁珠、石墨烯等)通常制备过程复杂，与抗体偶联条件不好控制，且有的材料需要信号读出设备，皆不适于现场检测。另一方面，传统的胶体金试纸条达不到很高的灵敏度，不能够很好地满足当前更加严格的呋喃唑酮限量标准的检测需求。但是，涉及到现场检测，胶体金仍然拥有绝对优势。因此，研究建立一种在胶体金的基础上放大信号，并且针对呋喃唑酮抗生素残留具有高灵敏度的免疫层析试纸条，这对现场检测和监控畜产品中的呋喃唑酮具有很重要的意义和应用价值。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷和不足，本专利技术的目的是提供一种生物探针、检测呋喃唑酮的试纸条及应用，该生物探针能显著减少抗体的用量，从而引发更激烈的竞争反应，提高灵敏度，使呋喃唑酮的可视化检测线达到0.3ng/mL。为达到上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：一种生物探针，包括检测探针和增强探针，所述的检测探针为纳米金标记的呋喃唑酮单克隆抗体，所述的增强探针为纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G。具体的，检测探针与增强探针的体积比为4～6:5～7，最好的，检测探针与增强探针的体积比为5:6。再具体的，所述的纳米金的粒径为15～20nm；纳米金与抗呋喃唑酮单克隆抗体的体积比为1000:5～9；最好的，纳米金与抗呋喃唑酮单克隆抗体的体积比为1000:7；纳米金与羊抗鼠免疫球蛋白G的体积比为1000:3～7，最好的，纳米金与羊抗鼠免疫球蛋白G的体积比为1000:5。进一步的，纳米金标记的呋喃唑酮单克隆抗体采用不饱和标记法制备得到，纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G采用不饱和标记法制备得到；纳米金的粒径为15～20nm；纳米金与抗呋喃唑酮单克隆抗体的体积比为1000:5～9；纳米金与羊抗鼠免疫球蛋白G的体积比为1000:3～7。一种检测呋喃唑酮的试纸条，所述的试纸条上载有所述的任一生物探针。具体的，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线，检测线包被有CPAOZ-BSA，结合垫上载有权利要求1-4所述的任一生物探针。进一步的，结合垫上载有权利要求1-4所述的任一生物探针的制备方法包括：将结合垫经封闭液浸渍封闭后，在结合垫上以5μL/cm的速率喷涂检测探针，在结合垫上以6μL/cm的速率喷涂增强探针。再进一步的，检测线包被有CPAOZ-BSA的制备方法包括：0.5mg/mL的CPAOZ-BSA包被液以0.2μL/cm的包被量包被于硝酸纤维素膜的检测线上。任一所述的生物探针用于检测呋喃唑酮的应用。任一所述的检测呋喃唑酮的试纸条用于检测奶粉中呋喃唑酮的应用。与现有技术相比，其优点与积极效果在于：(1)灵敏度高。本专利技术在传统胶体金试纸条的基础上，引入了金标二抗作为增强探针，由于单抗和二抗的特异性识别作用，两种探针会结合在一起，从而使大量的纳米金颗粒聚集在一起，形成网状结构，从而在检测线上形成更清晰的红色条带，起到放大信号的作用。(2)抗体用量少。本专利技术采用的双探针增强信号，可以显著减少抗体的用量，抗体用量的进一步减少将引发游离分析物与固定抗原之间对有限的抗体结合位点更加激烈的竞争，从而带来分析物与信号强度之间更敏感的浓度-反应关系。(3)操作简便。本专利技术采用的双探针均喷于同一个结合垫上，无需添加额外的试剂和操作，从而使分析过程快速、简便，且节省成本，可实现对呋喃唑酮代谢物的高灵敏度现场检测。因此可作为小型化、便携式的现场快速检测器件，特别是在临床诊断、食品卫生、环境监测及生物化学等领域有很好的应用前景。附图说明图1是本专利技术免疫层析试纸条构型图；图2是本专利技术免疫层析试纸条增强原理图；图3是本专利技术制备的免疫层析试纸条检测阳性样品过程图；图4是本专利技术制备的免疫层析试纸条检测阴性样品过程图；图5是本专利技术制备的免疫层析试纸条检测奶粉样品灵敏度；图6是本专利技术制备的免疫层析试纸条与传统的胶体金试纸条灵敏度对比；图7是对本专利技术制备的免疫层析试纸条进行验证；下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步的详细说明。具体实施方式本专利技术的生物探针包括使用纳米金标记的呋喃唑酮单克隆抗体(单抗)作为检测探针，纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(二抗)作为增强探针，两种探针均喷在同一个结合垫上，硝酸纤维膜上只包被检测线；由于单抗和二抗的特异性结合，两种探针结合在一起，从而其上的纳米金聚集在一起，一个金标单抗可以结合好几个金标二抗，一个金标二抗又可以结合好几个金标单抗，从而形成巨大的网状结构，聚集更多的纳米金，会在检测线(T)上形成更清晰的红色条带。呋喃唑酮单克隆抗体可以为现有技术中已有的单抗，最好为申请人课题组自己研发的高灵敏度呋喃唑酮单克隆抗体,与其余三种主要硝基呋喃抗生素无交叉反应。呋喃唑酮单克隆抗体是按照ZhangDaohong等人在刊物《AnalyticalChimicaActa》第635卷第63-69页题目为“Productionofultrasensitivegenericmo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物探针，其特征在于，包括检测探针和增强探针，所述的检测探针为纳米金标记的呋喃唑酮单克隆抗体，所述的增强探针为纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G。

【技术特征摘要】
1.一种生物探针，其特征在于，包括检测探针和增强探针，所述的检测探针为纳米金标记的呋喃唑酮单克隆抗体，所述的增强探针为纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G。2.如权利要求1所述的生物探针，其特征在于，检测探针与增强探针的体积比为4～6:5～7。3.如权利要求1或2所述的生物探针，其特征在于，所述的纳米金的粒径为15～20nm；纳米金与抗呋喃唑酮单克隆抗体的体积比为1000:5～9；纳米金与羊抗鼠免疫球蛋白G的体积比为1000:3～7。4.如权利要求1或2所述的生物探针，其特征在于，纳米金标记的呋喃唑酮单克隆抗体采用不饱和标记法制备得到，纳米金标记的羊抗鼠免疫球蛋白G采用不饱和标记法制备得到；纳米金的粒径为15～20nm；纳米金与抗呋喃唑酮单克隆抗体的体积比为1000:5～9；纳米金与羊抗鼠免疫球蛋白G的体积比为1000:3～7。5.一种检测呋喃唑酮的试纸条，其特征在于，所述的试纸条上载有权利要求1-4所述的任一生物探针。6.如权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：张道宏，窦磊娜，王建龙，补彤，黄琼，闫灵芝，赵兵欣，赵东阳，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61