一种产小柱孢酮的灰霉菌突变株Δbcscd1及其构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，以野生型灰霉菌菌株为背景菌株，对其黑色素合成途径一个关键酶小柱孢酮脱水酶进行基因敲除，构建能够大量产生小柱孢酮的灰霉菌基因缺失突变菌株Δbcscd1，主要步骤如下：利用融合PCR技术，将目的基因bcscd1的5'‑UTR和3'‑UTR分别与潮霉素片段Hph的上下游编码区融合，获得上下游融合片段，利用PEG介导的原生质体转化法将融合片段转入野生型原生质体中进行双交换同源重组，通过筛选鉴定获得基因缺失突变株Δbcscd1。通过本发明专利技术方法构建得到的基因缺失突变株遗传稳定性高且具有较低的毒性。本发明专利技术还提出了一种通过萃取，旋蒸以及柱层析等步骤特异性地提纯小柱孢酮的方法。

A small spore ketone of Botrytis cinerea mutant bcscd1 and its construction method

The invention belongs to the field of biotechnology, with wild type strains of Botrytis cinerea strains on the background, the melanin synthesis pathway is a key enzyme of column spore ketone dehydration enzyme gene knockout, construct gene deletion can produce a large number of Botrytis cinerea spore column ketone mutant strain bcscd1, the main steps are as follows: Using the integration of PCR technology, the the fusion of bcscd1 gene 5'UTR and 3' UTR respectively and hygromycin Hph fragment encoding region downstream, upstream and downstream fragment obtained by protoplast fusion, transformation mediated by PEG fusion fragments into the double exchange of homologous recombinant wild-type protoplasts, identified by screening the mutant strain a0153 bcscd1. The gene deletion mutant obtained by this method has high genetic stability and low toxicity. The invention also provides a method by extraction, distillation and column chromatography steps specific purification column from ketone.

【技术实现步骤摘要】
一种产小柱孢酮的灰霉菌突变株Δbcscd1及其构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种能够大量产生小柱孢酮(scytalone)的灰霉菌基因缺失突变株Δbcscd1的构建，及小柱孢酮的分离纯化方法。
技术介绍
黑色素是由酚类或吲哚类物质氧化聚合形成的多聚物，细菌、真菌、植物和动物均可以产生黑色素。研究表明，黑色素的天然理化特性赋予黑色素诸多普遍的生物学功能，如抗紫外辐射、抗氧化、抗水解酶类、结合重金属、抗杀菌剂、抗极端温度及干旱等等。这些功能使得黑色素对于生物体的生存和自我保护具有重要的作用。因此，真菌合成的黑色素对于其生理活动有重要的作用。真菌黑色素对于人类的日常生活也有很大的用途，具有多种应用价值，如黑色素具有防紫外线辐射的功能，因此可被用于日用化妆品工业制备防晒霜和染发剂；黑色素可以保护生物体减少重金属和极端温度的伤害，也可用作生物抗氧化剂，还可以作为生物半导体材料；食用真菌栽培过程中菌丝体转色和黑色素积累是出菇的重要前提；研究发现一些可溶性的黑色素对一些病毒如艾滋病病毒有显著的抑制效果等等。目前黑色素已经小规模用于医药、化妆品、电子及食品领域。因此来源于真菌的天然黑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大量积累小柱孢酮的灰霉菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于，将小柱孢酮脱水酶编码基因Bcscd1进行敲除，得到所述大量积累小柱孢酮的灰霉菌基因工程菌株。

【技术特征摘要】
1.一种大量积累小柱孢酮的灰霉菌基因工程菌株的构建方法，其特征在于，将小柱孢酮脱水酶编码基因Bcscd1进行敲除，得到所述大量积累小柱孢酮的灰霉菌基因工程菌株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述积累小柱孢酮的灰霉菌菌株为灰霉菌(Botrytiscinerea)B05.10。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：(1)融合PCR获得转化片段以野生型灰霉菌的DNA为模板，在基因bcscd1的上游非编码区设计特异性引物Bcscd1-U-F和Bcscd1-U-R，利用这一对引物和PCR技术扩增Bcscd1起始密码子上游非编码区5'Bcscd1片段；以野生型灰霉菌的DNA为模板，在基因Bcscd1的下游非编码区设计特异性引物Bcscd1-D-F和Bcscd1-D-R，利用这一对引物和PCR技术扩增Bcscd1终止密码子下游非编码区3'Bcscd1片段；以质粒为模板，用引物Hph-F和Hph–R扩增含5'和3'两个接头的潮霉素抗性基因Hph片段；(2)PEG介导的灰霉菌原生质体转化法利用PEG介导的原生质体转化法，将回收后的5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1扩增产物转入野生型菌株B05.10的原生质体中。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增bcscd1起始密码子上游非编码区5'Bcscd1片段的PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，34个循环，68℃终延伸10min，得到5'Bcscd1片段。所述扩增bcscd1终止密码子下游非编码区3'Bcscd1片段PCR的条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，34个循环，68℃终延伸10min，得到3'Bcscd1片段；所述扩增Hph片段的PCR条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸2min，34个循环，68℃终延伸10min，得到Hph片段；将上述三种PCR产物5'Bcscd1片段，3'Bcscd1片段，Hph片段进行等摩尔数混合，以该混合物为模板，用引物Bcscd1-U-F和Bcscd1-D-R进行高保真融合PCR扩增，得到融合片段5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1；所述扩增5'Bcscd1-Hph-3'Bcscd1的融合PCR条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸5min，34个循环，68℃终延伸10min，得到5'Bcscd1-Hph...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱品宽，向升，何一凡，张成花，许玲，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31