一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球及其制备方法和应用；该修饰反蛋白石光子晶体微球可以有效地特异性富集、净化黄曲霉毒素；使用30ul修饰反蛋白石光子晶体微球作为免疫亲和材料，能够富集AFB1量最多达到50ng，标品的洗脱率能达到90％；同时本发明专利技术的制备方法简单方便，原料价格低廉，节约成本。通过该修饰反蛋白石光子晶体微球用于富集、净化、检测农产品中的AFB1的方法富集毒素的效果好，同时能够节约装填柱子的过程，使得操作更简易方便。

A modified inverse opal photonic crystal microsphere, which is used to enrich, purify and detect AFB1, and its preparation and Application

The invention discloses a method for enrichment and purification, detection of AFB1 modified inverse opal photonic crystal microsphere and its preparation method and application; the modified inverse opal photonic crystal microsphere can effectively the specificity of enrichment and purification of aflatoxin; using 30ul modified inverse opal photonic crystal microsphere as immunoaffinity materials to enrichment AFB1 up to 50NG, the elution rate can reach 90% of the standard; and the preparation method of the invention is simple and convenient, low price of raw materials, cost savings. The modified opal photonic crystal microspheres can be used to enrich, purify and detect AFB1 in agricultural products. The method has good effect on enriching toxin, and can save the process of loading columns, making the operation simpler and more convenient.

【技术实现步骤摘要】
一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球及其制备方法和应用
本专利技术涉及对农产品中的AFB1的富集和检测。具体涉及一种用于富集检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球及其制备方法和应用
技术介绍
农产品中的AFB1(黄曲霉毒素)污染，成为影响食品安全，危害人们身体健康的巨型杀手。但长期以来，由于检测技术落后，制约着对农产品黄曲霉毒素污染的控制，也限制着我国农产品的出口。AFB1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。AFB1对哺乳动物毒性最大，会引起突变、致畸和肝损伤。黄曲霉毒素的检测有许多方法，主要方法有薄层色谱法、酶联免疫吸附测定法、高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。黄曲霉毒素的检测通常采用HPLC，具有安全可靠、灵敏性好、准确度高、分辨率高等许多优点，被认为是最权威的检测黄曲霉毒素的方法，特别是反相高效液相色谱法。在HPLC检测黄曲霉毒素之前，样品需要进行前处理。前处理的方法通常采用免疫亲和柱净化样品。但是商业化的免疫亲和柱价格昂贵，同时装柱的过程复杂，填充材料为1mL柱容量一般在200ng。因此，开发一种价格相对低廉，减少装柱的过程，使得操作更简单，富集效果更好的富集净化黄曲霉毒素的材料具有重要意义。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术通过一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球，该修饰反蛋白石光子晶体微球可以有效地特异性富集、净化黄曲霉毒素。本专利技术的另一个目的是提供该用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球的制备方法和应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球，由反蛋白石光子晶体微球作为免疫亲和材料的载体，对微球进行羟基化修饰、氨基修饰和醛基修饰，再在微球表面修饰固定上AFB1单克隆抗体。本专利技术所述的修饰反蛋白石光子晶体微球的制备方法，包括如下步骤：(1)反蛋白石光子晶体微球的制备：将二氧化硅和聚苯乙烯混合纳米乳液作为水相，将甲基硅油作为油相，使油相截断水相形成油包水型微球；将油包水型微球加热至水分蒸发完全，干燥固化；再清洗高温煅烧；降至室温，去除聚苯乙烯微球模板，留下有序的反蛋白石光子晶体微球；(2)反蛋白石光子晶体微球表面的修饰：将步骤(1)得到的反蛋白石光子晶体微球通过进行表面羟基化修饰，再对微球表面进行氨基修饰，最后对微球表面进行醛基修饰；(3)抗体的固定：通过化学键合方法将AFB1单克隆抗体固定于经过步骤(2)修饰得到的微球表面，得到修饰反蛋白石光子晶体微球。作为优选，步骤(2)所述羟基化修饰为将反蛋白石光子晶体置于食人鱼溶液，室温震荡；清洗后烘干，使微球表面修饰上羟基。优选食人鱼溶液(浓硫酸:双氧水(v:v)＝7:3)中，按10uL/每微球，振荡反应。进一步地，步骤(2)所述氨基修饰为将羟基化修饰的反蛋白石光子晶体置于含APTMS的甲苯溶液，震荡后清洗，使微球表面修饰上氨基。优选将微球放入含体积分数5％APTMS的甲苯溶液中，按10uL/每微球，振荡反应。更进一步地，步骤(2)所述醛基修饰为将氨基修饰的反蛋白石光子晶体置于戊二醛水溶液中，室温震荡，待微球由白色变为橘红色反应完毕，反应完毕清洗；使微球表面修饰上醛基。优选体积分数2.5％戊二醛水溶液，按10uL/每微球，振荡反应。本专利技术所述的修饰反蛋白石光子晶体微球的富集、净化、检测AFB1中的应用。进一步地，所述的修饰反蛋白石光子晶体微球的富集、净化、检测AFB1标准品或者农作物样品中AFB1的应用。其中，所述富集过程为向修饰反蛋白石光子晶体微球加入不同浓度的AFB1标准品或者含AFB1农作物样品进行抗原抗体结合反应。进一步地，所述农产品样品为加入AFB1甲醇溶液的农产品样品，包括大米、小麦和玉米。进一步地，所述净化、检测过程为将抗原抗体结合的修饰反蛋白石光子晶体微球用甲醇进行AFB1洗脱，洗脱液吹干后进行衍生，衍生化后吹干，加入甲醇溶液，使用HPLC检测。本专利技术的原理如图1所示，在粒径大小相同的反蛋白石光子晶体微球表面用食人鱼(双氧水：浓硫酸为3:7v/v)溶液进行羟基化修饰，用含APTES甲苯溶液(5％APTESv/v)对微球表面进行氨基修饰，再用体积分数2.5％戊二醛水溶液对微球表面修饰醛基，固定AFB1-抗体，富集AFB1，使用纯甲醇洗脱液将AFB1进行洗脱，柱前衍生化后通过HPLC进行检测，建立标准曲线。本专利技术使用修饰反蛋白石光子晶体微球免疫亲和-HPLC富集、净化和检测AFB1的应用方法，是采用反蛋白石光子晶体微球为免疫亲和载体，在微球表面修饰AFB1-抗体，以AFB1为检测对象，通过抗体抗原特异性结合富集AFB1，纯甲醇洗脱液净化AFB1，柱前衍生化后通过HPLC检测检荧光值。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术制备得到的修饰反蛋白石光子晶体微球可以有效地特异性富集、净化黄曲霉毒素；使用30ul修饰反蛋白石光子晶体微球作为免疫亲和材料，能够富集AFB1量最多达到50ng，标品的洗脱率能达到90％；同时本专利技术的制备方法简单方便，原料价格低廉，节约成本。通过该修饰反蛋白石光子晶体微球用于富集、净化、检测农产品中的AFB1的方法富集毒素的效果好，净化洗脱率高，检测准确；同时能够节约装填柱子的过程，使得操作更简易方便。附图说明图1为反蛋白石光子晶体微球免疫亲和-HPLC检测AFB1原理图；图2为实施例2检测AFB1标准曲线关系图；图3为实施例2中AFB1富集洗脱量与标品对比关系图；图4为实施例2中AFB1洗脱率关系图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术所用AFB1、AFB1单克隆抗体、戊二醛、APTES购于Sigma-Aldrich。甲基硅油购于宇诺公司。无水乙醇、浓硫酸、化学纯甲醇、正己烷购于南京化学试剂公司。甲苯购于中国联式化工试剂有限公司(上海)。色谱级甲醇购于德国默克公司。三氟乙酸购于北京百灵威科技有限公司。谷物包括大米、玉米和小麦购于南京苏果超市。本专利技术所用的仪器主要有：KQ-300B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司JSM-5610LV型扫描电子显微镜日本日立公司DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司OTL1200管式炉南京南大仪器厂LSP01-1A微流注射泵河北保定兰格恒流泵有限公司ZQTY-70-T型震荡培养箱上海知楚仪器有限公司摇床FW177型中药粉碎机长沙市常宏制药机械设备厂QL-866型漩涡混合仪海门麒麟医用仪器厂MJ33型金相显微镜广州明美光电技术有限公司USB2000+光纤光谱仪蔚海光学仪器(上海)有限公司TS-1000型脱色摇床海门其林贝尔仪器制造有限公司Agilent1100型高效液相色谱仪美国Agilent公司HH-S2型恒温水浴锅金坛市医疗仪器厂单分散二氧化硅纳米颗粒的制备：采用改进法合成。实施例1(1)反蛋白石光子晶体微球的制备：将装有18％mg/mL二氧化硅(20nm)和9.4％mg/mL聚苯乙烯(280nm)混合纳米乳液的注射器作为水相，将装有纯甲基硅油的注射器作为油相，注射器连接微流注射泵，注射器针头连接三通管，控制流速(二氧化硅、聚苯乙烯乳液流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球，其特征在于，由反蛋白石光子晶体微球作为免疫亲和材料的载体，对微球进行羟基化修饰、氨基修饰和醛基修饰，再在微球表面修饰固定上AFB1单克隆抗体制成。

【技术特征摘要】
1.一种用于富集、净化、检测AFB1的修饰反蛋白石光子晶体微球，其特征在于，由反蛋白石光子晶体微球作为免疫亲和材料的载体，对微球进行羟基化修饰、氨基修饰和醛基修饰，再在微球表面修饰固定上AFB1单克隆抗体制成。2.一种权利要求1所述的修饰反蛋白石光子晶体微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)反蛋白石光子晶体微球的制备：将二氧化硅和聚苯乙烯混合纳米乳液作为水相，将甲基硅油作为油相，使油相截断水相形成油包水型微球；将油包水型微球加热至水分蒸发完全，干燥固化；再清洗高温煅烧；降至室温，去除聚苯乙烯微球模板，留下有序的反蛋白石光子晶体微球；(2)反蛋白石光子晶体微球表面的修饰：将步骤(1)得到的反蛋白石光子晶体微球通过进行表面羟基化修饰，再对微球表面进行氨基修饰，最后对微球表面进行醛基修饰；(3)抗体的固定：通过化学键合方法将AFB1-抗体固定于经过步骤(2)修饰得到的微球表面，得到修饰反蛋白石光子晶体微球。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述羟基化修饰为将反蛋白石光子晶体置于食人鱼溶液，室温震荡；清洗后烘干，使微球表面修饰上羟基。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建林，郑茜，李玮，郑铁松，金岩昊，李奕辰，李亚维，马六十，刘妍，丁志，邓杨，朱瑞雪，蔡婷婷，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32