一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法技术

本发明专利技术涉及细胞遗传学领域，具体涉及一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法，通过制备染色体玻片标本、CMA/DAPI染色、荧光检测、图像分析等步骤，重点解决了现有鉴别啤酒花雌雄株鉴定时期晚、复杂繁琐的分子生物学方法，提供一种简便、快捷、准确的方法。本发明专利技术提供的方法与单荧光染色发相比可以更好地显示啤酒花染色体的结构，特别是雌株和雄株的染色体核仁组织区形态结构。

A method for rapid identification of female and male sex of hops in Seedling Stage

The present invention relates to the field of cytogenetics, particularly relates to a method for rapid identification of beer seedling flowering plants sex, preparation of chromosome specimens, by CMA/DAPI staining, fluorescence detection and image analysis steps, focused on solving the existing methods of molecular biology identification of hops of male and female identification when late stage and complicated, provides a the method is simple, fast and accurate. Compared with single fluorescence staining, the method provided by this invention can better display the structure of hops chromosomes, especially the morphological structure of chromosomes and nucleolar organizer regions of female and male plants.

【技术实现步骤摘要】
一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法
本专利技术涉及细胞遗传学领域。具体地说，本专利技术涉及一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法。
技术介绍
啤酒花，学名HumuluslupulusL.，别名蛇麻草、陀得花等，是荨麻目大麻科葎草属,多年生藤蔓草本植物，茎、枝和叶柄密生绒毛和倒钩刺。啤酒花雌雄异株，雌花穗状，雄花圆锥花序，酿造所用均为雌花。啤酒花在世界许多地区均可生长，大部分种植区域集中在南北纬度35°～55°之间。目前，其主要产地分布在美国，欧洲、澳大利亚、南美洲和中国等地区。在啤酒酿造中添加啤酒花可赋予啤酒清爽的苦味和芬芳的香味，并具有防腐和澄清麦芽汁的功能。因此啤酒花被誉为“啤酒的灵魂”，自12世纪以来，至今它最主要的用途仍然是用于啤酒的酿造。啤酒花作为一种重要的药用植物，它的应用历史也十分悠久。13世纪开始，啤酒花就开始作为草药来使用。我国明代李时珍的《本草纲目》所引的宋代《开宝本草》中的一种中药“陀得花”指的就是啤酒花。近年来的研究表明，啤酒花不仅具有镇定、安神、健胃、杀菌、抗炎和利尿等作用，还具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和植物雌激素样作用等多种功效。基于染料的常用染色体显带技术(chromosomebandingtechnique)有N带、C带、G带、R带等，可以显示出染色体的基本形态特征如大小、主次缢痕。这些方法能反映出一定的生物学意义，在生物学研究中发挥了很大的作用，如植物进化生物学，人类和哺乳动物染色体研究。随着荧光染料的发现，荧光显带技术在核型分析中的应用日渐广泛。染色体荧光显带是利用荧光染料对染色体进行染色分带，原理是利用荧光染料与碱基对的特异性结合。常见的核酸荧光染料主要有CMA(色霉素A3)、DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)、PI(碘化丙啶)等。其中CMA为GC特异型荧光染料，DAPI为AT特异型荧光染料。染色体制片及双荧光染色具体方法因物种而异。不同的植物需要不同的对氯二苯的处理时间、温度，以及不同的根尖酶解时间等。这些因素都会影响最终的染色体形态结构及染色效果。例如：不同的对氯二苯处理时间和温度会使染色体的浓缩程度不同。如果根尖酶解时间过久，则在荧光显微镜下很有可能观察不到染色体。酶解时间不够，则细胞壁仍存在，染色体分散不开，不利于染色体结构观察。染色体双荧光染色的染料选择以及染色次序、染色时间对最终染色体形态结构的细节呈现都非常关键。单一的荧光染料常常不能显示染色体的整体结构。CMA与DAPI这两种荧光染料正好可以互补。但CMA染色在实际操作中存在一定难度，染色时间过短不利于染色体着色，染色时间过长显示不出染色体的细节结构。而且与DAPI的染色次序也很重要，因为DAPI着色往往较快，容易覆盖CMA的荧光。本专利提供了啤酒花根尖染色体制片及双荧光染色的具体方案。在生产种植中，人们只栽培经济效益大的雌性啤酒花。简单、快速的CMA/DAPI染色体双荧光染色法的应用可以在啤酒花苗期鉴定其性别，指导它的生产，对啤酒花经济产链的发展有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法，方法简单，染色效果好，能对啤酒花的雄雌做快速准确的判断。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法，包括下述步骤：染色体标本制作：(1)啤酒花植株根尖长至2-3cm，且顶端圆润饱满；(2)切下生长旺盛的根尖2.5-3mm，用饱和对二氯苯溶液4℃下处理20-24h；(3)按照常规方式对根尖进行低渗和固定；优选的，步骤(3)中的步骤具体为：吸掉饱和对二氯苯，加0.075mol/LKCl溶液，室温下前低渗30-40min，之后加新配制的卡诺固定液(乙酸：乙醇＝1：3，体积比)，室温下固定24-48h；(4)按照常规方式彻底清洗固定液；优选的，步骤(4)中的步骤具体为：将固定后的根尖用蒸馏水洗3次，每次在摇床上摇5min(摇床转速15-20转/min)，充分洗去固定液；(5)用1％(质量比)果胶酶Y-23(KikkomanCorporation)和4％(质量比)纤维素酶OnozukaRS(YakultCo.LTD)混合液，每个根尖15-20μl酶液，37℃酶解90min；(6)吸取一个根尖到洗净晾干的载玻片上，体视镜下用解剖针去除根尖分生区以外的部位和杂质，轻轻敲碎根尖至浆状；(7)在根尖上滴加10-15μl60％冰乙酸，待液滴透明后滴加40-50μl的卡诺固定液展片，将玻片置于80℃热台上干燥5-8min；(8)于20倍相差显微镜下镜检，挑选出背景干净、分裂相较多的染色体片做下一步荧光染色；染色体双荧光染色：(1)将CMA滴加到染色体片上，80-100μl/片，盖膜，避光孵育2h；(2)在磷酸缓冲液(PBS)中清洗3-5min；(3)将DAPI滴加到染色体片上，80-100μl/片，盖膜，避光孵育5min；(4)在磷酸缓冲液中迅速清洗后放入抗淬灭剂CitifluorAF1((ProSciTechPtyLtd,Australia))中，避光保存；(5)荧光显微镜(OlympusAH3)下观察，B激发滤块下观察CMA染色的染色体，呈黄色荧光，U激发滤块下观察DAPI染色的染色体，呈蓝色荧光。以上所述的方案，优选的判定方法为：二倍体雄性啤酒花的核型公式是：14m+4sm+Xm+Ym；在六号染色体上有两个NORs位点；二倍体雌性啤酒花的核型公式是：14m+4sm+2Xm。以上所述的方案，优选的判定方法为：不论是雌性还是雄性啤酒花都有两个NORs，但是通过CMA染色，发现雌性啤酒花两个NORs，只有一个位点有活性，呈伸展状态，另一位点沉默，呈浓缩状态。然而在雄性啤酒花中，两个NORs都有活性，都呈伸展状态。相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术在现有技术基础上，用饱和对二氯苯溶液4℃下处理20-24h的根尖，在KCl溶液中室温低渗30-40min，采用卡诺固定液固定24h以上后，用蒸馏水清洗根尖后酶解，加冰醋酸透明，卡诺固定液展片，使啤酒花中期染色体凝聚较好，根尖细胞解离充分，染色体分散均匀、容易观察。(2)本专利技术采用CMA/DAPI双荧光染色方法，步骤简便，无污染，并能得到更加清晰的啤酒花中期染色体图像。(3)本专利技术清楚地显示了啤酒花的染色体，荧光信号强，确定了适合啤酒花的染色体荧光染色的方法。(4)本专利技术通过观察细胞分裂中期染色体的结构细节，如染色体臂长短，着丝粒，随体等在啤酒花雌雄株中的区别，在苗期辨析啤酒花雌雄，对于啤酒花染色体结构分析，引种栽培和资源的保护利用具有重要的理论和实践意义。(5)利用本专利技术提供的染色方法，首次发现，不论是雌性还是雄性啤酒花都有两个NORs，但是通过CMA染色，发现雌性啤酒花两个NORs，只有一个位点有活性，呈伸展状态，另一位点沉默，呈浓缩状态，然而在雄性啤酒花中，两个NORs都有活性，都呈伸展状态，为今后的啤酒花的雌雄株的鉴别提供了新的参考。附图说明图1为啤酒花根尖体细胞中期染色体DAPI/CMA双色荧光染色图像示意图。其中图1中A、B为雄性啤酒花中期染色体，C、D为雌性啤酒花染色体。有尾箭头所指为染色体上呈伸展状态、有活性的核仁组织区(nucleolusorganizerreg本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法，包括下述步骤：染色体标本制作：（1）啤酒花植株根尖长至2‑3 cm，且顶端圆润饱满；（2）切下生长旺盛的根尖2.5‑3 mm，用饱和对二氯苯溶液4℃下处理20 ‑24 h；（3）按照常规方式对根尖进行低渗和固定；（4）按照常规方式彻底清洗固定液；（5）用1%果胶酶 Y‑23 和4%纤维素酶 Onozuka RS混合液，每个根尖15‑ 20 μl酶液，37℃酶解90 min；（6）吸取一个根尖到洗净晾干的载玻片上，体视镜下用解剖针去除根尖分生区以外的部位和杂质，轻轻敲碎根尖至浆状；（7）在根尖上滴加10‑15 μl 60% 冰乙酸，待液滴透明后滴加40‑50 μl的卡诺固定液展片，将玻片置于80℃热台上干燥5‑8 min；（8）于20倍相差显微镜下镜检，挑选出背景干净、分裂相较多的染色体片做下一步荧光染色；染色体双荧光染色：（1）将CMA滴加到染色体片上，80‑100 μl/片，盖膜，避光孵育2 h；（2）在磷酸缓冲液（PBS）中清洗3‑5 min；（3）将DAPI滴加到染色体片上，80‑100 μl/片，盖膜，避光孵育5 min；（4）在磷酸缓冲液中迅速清洗后放入抗淬灭剂Citifluor AF1中，避光保存；（5）荧光显微镜下观察，B激发滤块下观察CMA染色的染色体，呈黄色荧光，U激发滤块下观察DAPI染色的染色体，呈蓝色荧光。...

【技术特征摘要】
1.一种苗期快速鉴定啤酒花植株雌雄性别的方法，包括下述步骤：染色体标本制作：（1）啤酒花植株根尖长至2-3cm，且顶端圆润饱满；（2）切下生长旺盛的根尖2.5-3mm，用饱和对二氯苯溶液4℃下处理20-24h；（3）按照常规方式对根尖进行低渗和固定；（4）按照常规方式彻底清洗固定液；（5）用1%果胶酶Y-23和4%纤维素酶OnozukaRS混合液，每个根尖15-20μl酶液，37℃酶解90min；（6）吸取一个根尖到洗净晾干的载玻片上，体视镜下用解剖针去除根尖分生区以外的部位和杂质，轻轻敲碎根尖至浆状；（7）在根尖上滴加10-15μl60%冰乙酸，待液滴透明后滴加40-50μl的卡诺固定液展片，将玻片置于80℃热台上干燥5-8min；（8）于20倍相差显微镜下镜检，挑选出背景干净、分裂相较多的染色体片做下一步荧光染色；染色体双荧光染色：（1）将CMA滴加到染色体片上，80-100μl/片，盖膜，避光孵育2h；（2）在磷酸缓冲液（PBS）中清洗3-5min；（3）将DAPI滴加到染色体...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈春丽，张露怡，余昌秀，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42