一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及属于生物工程领域，特别涉及一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法及其作为抗感染药物的应用；一种大肠杆菌裂解酶，其特征在于其氨基酸序列为Seq ID NO.2。利用生物工程技术开发能够高效杀灭大肠杆菌的酶制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够特异性的灭活多种大肠杆菌，为目前防控奶牛乳房炎中的大肠杆菌提供一种安全、无毒副作用的酶制剂来源。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程领域，特别是一种大肠杆菌裂解酶及其制备方法与应用。
技术介绍
大肠杆菌是一种重要的人畜共患病原菌。可以引起动物腹泻、出血性肠炎，严重的可以导致死亡。而多年来抗生素的滥用导致产生的大肠杆菌超级细菌给人类健康和畜禽养殖业带来了巨大危害，亟需研发新型安全的防控措施。噬菌体裂解酶被认为是高效的生物酶抗生素，在当前微生物耐药性日益严重的情况下，裂解酶在动物疫病防控领域的应用前景被全球科学家高度关注。虽然裂解酶来源于噬菌体，但由于噬菌体裂解谱较窄，并且在应用过程中存在变异等的问题，而限制其应用。细菌噬菌体裂解酶是一种新的细菌细胞壁裂解酶，由噬菌体基因组编码，在噬菌体复制后期起释放病毒粒子作用。经典的裂解酶具备两个独立的功能区，包括N端的裂解酶活性区(catalyticdomain,CD)和C端的细胞壁结合区(cellwallbindingdomain，CBD)，分别具有裂解酶活性和细胞壁结合活性。一般来说，裂解酶的N端为裂解活性域，可以特异性的破坏肽聚糖的化学键，根据裂解酶可以裂解的化学键可以将其分为几类：溶菌酶(lysozyme)、酰胺酶(amidase)和内肽酶(endopeptidase)。而相比之下，革兰氏阴性菌裂解酶大多数情况下只有一个裂解活性区域，而没有结合区，大小也只有15-20kDa。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供一种新型大肠杆菌裂解酶及其制备方法，该裂解酶对大肠杆菌引起的奶牛乳房炎感染具有显著的防治效果，可以特异性的灭活金葡菌，为工业化生产抗菌制剂提供原料来源，本专利技术是这样实现的：一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDNO.1所示(ATGCARATHTTYAAYATGMGNACNAAYGAYGARGGNGTNYTNGGNYTNMGNYTNACNYTNTAYAARGAYACNMGNGGNTTYTGGACNATHGGNGCNGGNATHTGGACNGTNTGYGCNAAYCCNGTNTGYGCNGGNGCNYTNGAYMGNATGATHGGNMGNAARTGYAAYCCNACNGTNTGYYTNYTNAARGCNMGNAARCARTTYAAYAARAARGTNAAYAARGCNGGNMGNGGNGCNATHGCNGGNAAYGCNWSNGTNAARCCNGTNTAYAARWSNYTNAARGCNGGNYTNGCNWSNGCNYTNGTNAAYATGGCNTTYMGNMGNGCNWSNTTYCCNTAYAAYGTNGCNTTYMGNWSNYTNMGNYTNYTNAARAARCARAARMGNTGGMGNAAYYTNAAYGCNGGNAARGCNTGYMGNAARTGGTAYMGNCARACNCCNAAYMGNGCNAARMGNGTNATHAARACNTGGGCNGGNGGNAARGTNWSNMGNMGNGAYATHGAR)，氨基酸序列如SeqIDNO.2所示(MQIFNMRTNDEGVLGLRLTLYKDTRGFWTIGAGIWTVCANPVCAGALDRMIGRKCNPTVCLLKARKQFNKKVNKAGRGAIAGNASVKPVYKSLKAGLASALVNMAFRRASFPYNVAFRSLRLLKKQKRWRNLNAGKACRKWYRQTPNRAKRVIKTWAGGKVSRRDIE)。所述大肠杆菌裂解酶的制备方法，其特征在于，按如下步骤实现：1)该裂解酶的重组毕赤酵母表达载体的构建：如所述的大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的核酸序列和毕赤酵母表达载体pPIC9K通过双酶切方式构建裂解酶毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1；2)毕赤酵母的转化及筛选：用限制性内切酶酶切裂解酶毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1与酵母GS115感受态细胞通过电击法制备电转细胞，将细胞涂布于含2.0mg/mlG418的MDD-山梨醇平板，所述的平板含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％D-葡萄糖，1MD-山梨醇，然后倒置平板于28-30℃培养，2-4天后出现转化子，筛选出高表达菌株；随机挑取生长出的酵母菌落于YPD培养，按照Promega公司酵母基因组提取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行PCR扩增LysBM1基因，电泳显示与大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1序列大小一致，说明酵母高效表达菌株建立成功；3)诱导表达：挑取阳性克隆，分别接种于50mlBMGY培养基，所述的培养基为酵母提取物1％，胰蛋白胨2％，磷酸钾缓冲液(pH6.0)100mmol/L，YNB1.34％，生物素4×10-5％，甘油1％，30℃，250rpm振荡培养至OD600在4-6之间时取出，1500g离心5min，收集酵母细胞，然后重悬于装有1/5体积的BMMY培养基中，其中所述的培养为酵母提取物1％、胰蛋白胨2％、磷酸钾缓冲液pH6.0100mmol/L、YNB1.34％、生物素4×10-5％、甲醇3％，三角瓶中继续培养，24小时以后，每天补加甲醇至终浓度为2.5-3％，持续培养6-10天，离心取上清；电泳显示有目的蛋白表达，经测定蛋白量可达到200mg/L。所述一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1在制备防治大肠杆菌感染和污染药物中的应用。所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于将纯化的裂解酶产物制备防治奶牛养殖场中大肠杆菌引起的奶牛乳房炎药物中的应用。所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于以重组表达抗菌肽嵌合大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1裂解酶产物制成抗感染药物。所述的一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的应用，其特征在于：将纯化的裂解酶产物与各种赋形剂复配后制备防治各种大肠杆菌的感染和污染药物中的应用。有益效果1、我们前期在江苏某猪场污水分离到研究发现一株大肠杆菌的裂解性噬菌体V_EcoM_BM1。通过全基因组测序获得其裂解酶基因LysBM1。LysBM1氨基酸序列与已报道大肠杆菌O157噬菌体phiE142同源性最高，但只有61％。蛋白同源建模分析发现，裂解酶LysBM1与phiE142高级结构很相似，具有典型的裂解酶功能域特征(lysozyme-likestructuraldomainsuperfamily)。裂解酶LysBM1用毕赤酵母重组表达后具备体外抗菌活性且可以高效穿透EHEC外膜，而裂解酶phiE142无体外抗菌活性。扫描电镜分析及流式细胞仪检测，可明显发现LysBM1穿透细菌外膜，证实为高穿透性裂解酶。该裂解酶为当前首次发现。2、本专利技术结合裂解酶及抗菌肽的优点，针对细菌细胞壁作为靶标进行杀菌，用于防治多种大肠杆菌，该大肠杆菌裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制剂，用以防治由大肠杆菌引起的各种污染和感染，特别是奶牛养殖场中由大肠杆菌引起的奶牛乳房炎感染，具有极高的防治效果，且安全无毒副作用。附图说明图1重组表达嵌合裂解酶LysBM1毕赤酵母GS115基因组PCR检测M:DNAMarker10000bp1:未转化毕赤酵母GS115基因组；2：转化后挑选单克隆1基因组；3：转化后挑选单克隆2基因组；4：转化后挑选单克隆3基因组；图2嵌合裂解酶LysBM1及phiE142酵母表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1，其特征在于：其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1，其特征在于：其核苷酸序列如SeqIDNO.1所示，氨基酸序列如SeqIDNO.2所示。2.如权利要求1所述大肠杆菌裂解酶的制备方法，其特征在于，按如下步骤实现：1）该裂解酶的重组毕赤酵母表达载体的构建：如权利要求1所述的大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1的核酸序列和毕赤酵母表达载体pPIC9K通过双酶切方式构建裂解酶毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1；2）毕赤酵母的转化及筛选：用限制性内切酶酶切裂解酶毕赤酵母表达载体pPIC9K-BM1与酵母GS115感受态细胞通过电击法制备电转细胞，将细胞涂布于含2.0mg/mlG418的MDD-山梨醇平板，所述的平板含有1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％D-葡萄糖，1MD-山梨醇，然后倒置平板于28-30℃培养，2-4天后出现转化子，筛选出高表达菌株；随机挑取生长出的酵母菌落于YPD培养，按照Promega公司酵母基因组提取试剂盒所述方法提取酵母基因组，并以其为模板进行PCR扩增LysBM1基因，电泳显示与大肠杆菌嵌合裂解酶LysBM1序列大小一致，说明酵母高效表达菌株建立成功；3）诱导表达：挑取阳性克隆，分别接种于50mlBMGY培养基，所述的培养基为酵母提取物1%，胰蛋白胨2%...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙利厂，王冉，张莉莉，何涛，庞茂达，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32