一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。所述抗菌肽的分子量为1736Da。本发明专利技术又公开了一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽的应用，在制备治疗或预防细菌的药物中的应用。本发明专利技术为后续进一步研究凡纳滨对虾的防御免疫机制及抗菌药物的开发奠定了基础。

A kind of antiseptic peptide of Penaeus vannamei hemocyanin and its application

The invention discloses an antibacterial peptide of Litopenaeus vannamei hemocyanin and its amino acid sequence shown in a sequence table SEQ ID NO:1. The molecular weight of the antibacterial peptide is 1736Da. The invention also discloses an application of the Penaeus vannamei hemocyanin antibacterial peptide and its application in the preparation of the drugs for the treatment or prevention of bacteria. The invention lays a foundation for further study on the Defense Immunity Mechanism of Penaeus vannamei and the development of antibacterials.

【技术实现步骤摘要】
一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用
本专利技术涉及水产养殖的
，尤其涉及一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用。
技术介绍
近年来，随着经济的发展，人们对水产品的需求日益增加，在捕捞量不能满足市场需求的情况下，水产养殖业得到了迅猛的发展。对虾是水产养殖中增长最快的产品之一，我国是养殖对虾年产量最高的国家。然而，与国际对虾养殖业相比，我国、我省对虾养殖业相对效益较低、发展后劲不足，可持续发展前景不容乐观。究其原因，主要与目前我国对虾养殖病害频发和生物安全所致对虾出口屡遭贸易壁垒等有关。血蓝蛋白又称血蓝素，是一种多功能蛋白，过去被称为呼吸蛋白，它是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，是节肢动物和软体动物血淋巴中发现的含铜的蓝绿色高分子量蛋白质，是氧的传递体，并且是已知的能与氧气可逆结合的唯一铜蛋白。抗菌肽(Antibac-terialpeptide)又叫抗微生物肽(Antimicrobialpep-tide)、抗生素肽(Antibioticspeptide)，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。迄今为止，国内外报道大约有2000多种抗菌肽被鉴定、分离出来，以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。在生物界自然存在的抗菌肽根据其结构的不同可以分为四大类：β折叠型抗菌肽、α螺旋型抗菌肽、延伸结构型多肽和loop结构型多肽。目前，我国对虾养殖业急需解决的共性关键问题包括：对虾传染性疫病的防控、品种的选育、营养研究、养殖环境控制以及对虾加工技术升级等。而要成功解决这些问题，阐明对虾免疫防御机制是前提和基础。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽及其应用，通过凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽S10构效关系的研究，为寻找新的对虾病害防控、良种选育的策略提供思路，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。为了解决上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。作为实施例的优选方式，所述抗菌肽的分子量为1736Da。一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽的应用，在制备治疗或预防细菌的药物中的应用。作为实施例的优选方式，所述细菌包括溶藻酸弧菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、河弧菌及乙型链球菌。本专利技术以凡纳滨对虾血蓝蛋白为研究对象，凡纳滨对虾的血蓝蛋白能产生功能性的抗菌肽，并且通过生物信息学在线预测肽段发现血蓝蛋白亚基中的12种肽段具有抗菌活性的可能性最大。在此基础之上选择一种肽段S10，用圆二色谱法得出最大吸收波长下的吸光度，再用CDpro软件计算出α-螺旋和β-折叠等结构的含量，因此初步预测S10的二级结构。然后研究S10对于七种水产致病菌的抗菌活性,最后先用Pymol软件对该肽进行3D模型预测，再用核磁共振法验证其二级结构。实验结果表明，该肽对七种致病菌都具有抑制作用。同时核磁共振法得到结构与软件预测基本一致。本专利技术为进一步研究凡纳滨对虾的免疫防御机制提供了基础。附图说明图1抗菌肽S10的3D模型；图2抗菌肽S10的HMBC谱；其中，横坐标为H谱，纵坐标为C谱；图3抗菌肽S10的NOESY谱；其中，横纵坐标皆为H谱；图4为本专利技术抗菌肽S10可能的空间结构。具体实施方式实施例1凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽的预测首先运用AntiBPServer、CAMP、APD2三个在线预测软件，预测凡纳滨对虾血蓝蛋白大、小亚基抗菌肽段，如表1、表2所示，总共预测得到34条可能具有抗菌活性的小分子片段，其中11条多肽序列(黑体加粗表示)可能会形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用而发挥抑菌作用，这些预测多肽分子量大小范围为1.5～1.9kDa。另外，预测结果显示，在血蓝蛋白N端的α螺旋域、C端的Ig-like域以及中间部分的保守铜离子结合域均有活性片段，其中铜离子结合域和Ig-like域占主要区域。表1凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基抗菌肽段的预测注：1、加粗多肽序列：根据其理化性质推测可能形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用发挥抑菌作用；2、Ⅰdomain：α螺旋域；Ⅱdomain：铜离子结合域；Ⅲdomain：Ig-like域。表2凡纳滨对虾血蓝蛋白小亚基抗菌肽段预测注：1、加粗多肽序列：根据其理化性质推测可能形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用发挥抑菌作用；2、Ⅰdomain：α螺旋域；Ⅱdomain：铜离子结合域；Ⅲdomain：Ig-like域。实施例2采用圆二色谱法分析凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽二级结构含量将实施1所述的11种(表1和表2中的加粗肽段)可能会形成α螺旋结构，且能与病原菌膜相互作用而发挥抑菌作用的肽段进行圆二色谱扫描,分析其结构含量。2.1实验器材2.1.1实验材料实验用抗菌肽由北京中科亚光生物科技有限公司(SciLightBiotechnology，LLC)合成，多肽N端乙酰化、C端酰胺化修饰，纯度为﹥95％。2.1.2实验仪器紫外分光光度计(UV5200)厂家：上海元析仪器有限公司圆二色谱仪(JascoJ-810)厂家：日本Jasco比色皿：1mm石英比色皿2.2样品制备利用紫外分光光度计在扫描范围是190nm-400nm中扫描11个样品的最长吸收波长，往样品中逐步加水直至吸光度为1，记录数据为圆二色谱作前期准备。2.3样品测试步骤2.3.1、开启仪器开启电脑，完全开启氮气瓶总阀，打开减压阀，使表头保持在0.1Pa。开启仪器侧面的氮气流量计，是气流保持在3-5L/min。打开仪器电源，仪器开始点灯(约需0.5min)，待仪器面板上“open”灯亮后，双击“SpectraManager”图标，在SpectraManager对话框中选择所需的测量法“SpectrumMeasurement”，仪器开始自我检查，约2min后，自检后，出现SpectrumMeasurement对话框，根据测试要求设置参数。2.3.2、参数设置Parameters设置参数：波长范围：190-250nm数据采集点：0.5nmScanningSpeed：100nm/minScanningMode：Continuous狭峰宽度：1nmDataMode设置：CD或FDCD(荧光CD)测试方法Option：选择注解有关参数2.3.3、样品测试将配制好的样品装进1mm石英比色皿中，放入样品架中，溶液样品架放在靠光圈侧，盖上盖板，点击START开始测试，当波长扫描至400nm一下，开启氮气保护，扫描结束自动生成SpectraAnalysis对话框。2.3.4、谱图处理点击生成的对话框中File菜单，选择saveas将CD谱图保存生成.jws文件。2.3.5、关机退出CD程序后关闭仪器主机电源，然后关去氮气瓶总阀，排出残留氮气，最后关闭仪器上的氮气流量计。2.4数据处理1、利用CDPro软件，把CD数据降序导出到记事本，另存为.inp格式，将其复制到CDPro文件中，先运行CRDATA.EXE，在运行SELLON3.EXE执行计算，结果打开sellon3.out查看。2、计算方法：α螺旋含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的一种凡纳滨对虾血蓝蛋白抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的分子量为1736Da。3.一种如权利要求1所述的凡纳滨对虾血蓝蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：章跃陵，杨燊，黄河，王帆，钟名其，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：广东,44