猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法技术

本发明专利技术提供了一种猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，所得到的疫苗免疫母猪，能起到一针多防的作用，填补了市场上目前缺少猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗的空白。该方法采用了特定的免疫佐剂，疫苗免疫后免疫部位不会引起红肿发热的副反应，不会影响免疫后猪的精神及采食情况，有效提升了免疫猪只的免疫效果以及生产性能。与现有技术中各单抗原疫苗相比免疫效力相当，保护率均在80％以上。同时，本发明专利技术方法有效提升了猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗质量的稳定性，克服了转瓶培养过程中操作繁杂、工作强度大、易污染等缺点。

Swine erysipelas, porcine parvovirus and swine influenza virus inactivated vaccine preparation method

The invention provides a swine erysipelas, porcine parvovirus and swine influenza virus inactivated vaccine preparation method, vaccine sows obtained, can play a multiple role, to fill the gaps in the market at present lack of swine erysipelas, porcine parvovirus and swine influenza virus inactivated vaccine. The method uses a specific immune adjuvant, vaccine immunization sites will not cause adverse reaction swelling and fever, will not affect the immune pigs after spirit and food intake, effectively enhance the immune efficacy and production performance of pigs. Compared with the single antigen vaccines in the existing technology, the immune effect is equal, and the protection rate is above 80%. At the same time, the method of the invention can effectively enhance the swine erysipelas, porcine parvovirus and swine influenza virus inactivated vaccine triple stability quality, overcomes the disadvantages of rotary bottle process of complex operation, high work intensity and pollution cultivation.

【技术实现步骤摘要】
猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法
本专利技术涉及疫苗
，进一步涉及多联疫苗的制备技术，具体涉及一种猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法。
技术介绍
猪丹毒(Swineerysipelas,SE)是由红斑丹毒丝菌(Brysipelothrixrhusiopathiae)引起的一种急型、热性传染病，又被称为红热病(redfever)，又叫“打火印”。临床上以高热、皮疹和关节炎为主要特征。猪丹毒广泛流行于世界各地，我国于20世纪80年代多发，与猪瘟、猪肺疫并称中国养猪业的三大传染病，在我国将猪丹毒列为二类疫病。该病沉寂20余年，然而，近年来，在我国广西、广东、四川、福建、江西、安徽、湖南等多地均有猪丹毒的发生，且有发病增多的趋势。猪丹毒的再一次发生和流行概括其原因可能为：猪丹毒杆菌具有广泛的宿主性，其中病猪和带菌猪是主要的传染源；猪丹毒杆菌对外界环境的抵抗力强，具有潜在的潜伏性；养殖户多年放弃免疫猪丹毒疫苗，非优势血清型猪丹毒杆菌经过几十年的进化与变异，毒力增强；与猪瘟、猪流行性腹泻、猪蓝耳病、副猪嗜血杆菌病、猪流感等伴发，加重了本病的发生与流行。猪细小病毒为引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，可以引起初产母猪胎猪死产、木乃伊胎、早期胚胎死亡和不育。该病广泛发生于世界各地，并在大多数猪场呈地方性流行。该病经常与其他一些病毒，比如猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒混合感染，诱发断奶仔猪多系统衰竭综合征。临床上发现了多种类型的猪细小病毒，包括PPV1、PPV2、PPV3、PPV4、猪类博卡病毒(Porcineboca-likevirus，PBo-likeV)、猪博卡病毒(PBoV)。研究资料显示，PPV3与猪繁殖与呼吸综合征病毒及PBo-likeV与猪圆环病毒混合感染的几率较高。猪流感，全称为猪流行感冒，是由A型流感病毒引起的猪的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，临床上以突然发生、呼吸困难、咳嗽、发热、衰竭，以及不经治疗而迅速康复为特征。在地方流行性传染病中，猪流感在临床上表现不明显或与其它呼吸道病很难区分。虽然猪流感可不治而愈，但是猪群感染SIV后，常常可增加猪群对其他呼吸道病原的易感性，增加了发生继发或混合感染的几率，从而发生猪的呼吸道疾病综合征(PRDC)，使猪群呼吸道疾病更为复杂。生猪的呼吸道疾病综合征(PRDC)涉及多种病原，例如猪流感病毒(SIV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪肺炎支原体(M.hyopneumonia)、猪圆环病毒(PCV)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、猪链球菌(Streptococcussuis)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，以解决现有技术的疫苗产品难以实现一次接种即可同时免疫上述多种病原的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是猪丹毒抗原、猪细小病毒抗原、猪流感病毒抗原在同一疫苗中混配时，难以保证抗原的免疫效果。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：1)培养猪丹毒杆菌2型C43-5菌株，制备得到活菌液；2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43-5活菌液中抗原浓度调整至109-1010CFU/mL；3)利用甲醛将步骤2)调整浓度后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液进行灭活；4)繁殖猪细小病毒BJ-2株，制备得到活毒液；5)利用甲醛将步骤4)中猪细小病毒BJ-2株毒液进行灭活；6)繁殖猪流感病毒H1N1株，制备得到活毒液；7)利用甲醛将步骤6)中猪流感病毒H1N1株毒液进行灭活；8)将步骤3)灭活后的猪丹毒杆菌C43-5菌液、步骤5)灭活的猪细小病毒BJ-2株毒液、步骤7)灭活的猪流感病毒H1N1株毒液以(1～2):(1～2):(1～2)的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；9)将步骤8)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗。作为优选，步骤4)所述活毒液中猪细小病毒BJ-2株病毒含量≥107.0TCID50。作为优选，步骤6)所述活毒液中猪流感病毒H1N1含量≥107.0TCID50。作为优选，步骤9)中所述佐剂为SEPPICIMS1313NVG佐剂。作为优选，步骤1)具体包括以下操作：按培养基总量的1％-2％接种菌株，同时按1％-2％加入裂解血球全血，或0.1％吐温-80和0.5％葡萄糖，混匀，在发酵罐中37℃发酵，溶氧量设定10％-15％，用氢氧化钠调节pH，pH设定为7.5-7.6，发酵10-11小时。作为优选，步骤3)所述灭活是按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟。作为优选，步骤4)具体包括以下操作：将IBRS-2细胞接种到含有培养液和微载体的反应器内，并将细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；细胞接种密度为10-20万/mL，所用微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-10g/L，所用生物反应器为搅拌式生物反应器，生物反应器容积为14L；生物反应器设定参数为：pH7.0-7.3、温度36-37℃、溶氧30％-50％、搅拌速度为40-60rpm；当细胞密度达到200-500万/mL，更换成病毒维持液，接种猪细小病毒，病毒接种量为0.01-0.1MOI，病毒维持液为含2％血清的DMEM，pH值7.1-7.4，生物反应器设定病毒繁殖参数为温度36-37℃，溶氧35-60％、搅拌速度为40-60rpm。作为优选，步骤5)所述灭活是在无菌容器内，向病毒液中加入甲醛溶液直至其中甲醛浓度为0.3％(w/w)，然后在37℃作用48小时，期间振摇3-4次。步骤6)具体包括以下操作：将MDCK细胞以1×105-2×105/mL的接种量接种到反应器内，并将细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；所用微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-10g/L，所用生物反应器为搅拌式生物反应器，生物反应器容积为14L；生物反应器设定参数为：pH7.0-7.2、温度33℃-37℃、溶氧30％-40％、搅拌速度为40-60rpm；当载体上80％-90％铺满细胞时，更换成含2μg/mL胰酶无血清的MEM培养基，接种猪流感病毒H1N1，病毒接种量为MOI0.002-0.005，继续培养。作为优选，步骤7)所述灭活是在无菌容器内，向病毒液中加入甲醛溶液直至其中甲醛浓度为0.3％(w/w)，然后在37℃作用48小时，期间振摇3-4次。在以上技术方案中，所述SEPPICIMS1313NVG佐剂，是指由SEPPIC公司出品的、型号为IMS1313NVG的疫苗佐剂，可自市面购得。本专利技术提供了一种猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，所得到的疫苗免疫母猪，能起到一针多防的作用，填补了市场上目前缺少猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗的空白。该方法采用了特定的免疫佐剂，疫苗免疫后免疫部位不会引起红肿发热的副反应，不会影响免疫后猪的精神及采食情况，有效本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)培养猪丹毒杆菌2型C43‑5菌株，制备得到活菌液；2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43‑5活菌液中抗原浓度调整至10

【技术特征摘要】
1.猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)培养猪丹毒杆菌2型C43-5菌株，制备得到活菌液；2)采用稀释或离心的方式将步骤1)得到的猪丹毒杆菌2型C43-5活菌液中抗原浓度调整至109-1010CFU/mL；3)利用甲醛将步骤2)调整浓度后的猪丹毒杆菌2型C43-5菌液进行灭活；4)繁殖猪细小病毒BJ-2株，制备得到活毒液；5)利用甲醛将步骤4)中猪细小病毒BJ-2株毒液进行灭活；6)繁殖猪流感病毒H1N1株，制备得到活毒液；7)利用甲醛将步骤6)中猪流感病毒H1N1株毒液进行灭活；8)将步骤3)灭活后的猪丹毒杆菌C43-5菌液、步骤5)灭活的猪细小病毒BJ-2株毒液、步骤7)灭活的猪流感病毒H1N1株毒液以(1～2):(1～2):(1～2)的体积比混匀，即得到混合的抗原溶液；9)将步骤8)得到的混合抗原溶液与佐剂混合，即得到猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述活毒液中猪细小病毒BJ-2株病毒含量≥107.0TCID50。3.根据权利要求1所述的猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤6)所述活毒液中猪流感病毒H1N1含量≥107.0TCID50。4.根据权利要求1所述的猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤9)中所述佐剂为SEPPICIMS1313NVG佐剂。5.根据权利要求1所述的猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1)具体包括以下操作：按培养基总量的1％-2％接种菌株，同时按1％-2％加入裂解血球全血，或0.1％吐温-80和0.5％葡萄糖，混匀，在发酵罐中37℃发酵，溶氧量设定10％-15％，用氢氧化钠调节pH，pH设定为7.5-7.6，发酵10-11小时。6.根据权利要求1所述的猪丹毒、猪细小病毒、猪流感病毒三联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3)所述灭活是按菌液体积加0.3％甲醛溶液，37℃灭活18～24小时，期间每隔2～3小时搅拌一次，每次3～5分钟。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：厚华艳，吕茂杰，付旭彬，郁宏伟，梁武，李守军，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12