芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用，针对传统骨修复方式宿主微环境缺乏血运、种子细胞在缺氧环境中易引起凋亡、成骨效果不佳等问题，利用芒果苷对种子细胞既有保护作用，又可促进其成骨能力，将之结合软骨内成骨体系进行骨修复的策略：将间充质干细胞种植于多孔骨支架材料上构建组织工程复合体，再在体外对其进行成软骨分化诱导培养2周，继而进行成肥大化软骨分化诱导培养2周后植入缺损区进行修复；芒果苷可以负载于多孔骨支架材料，也可整体系统给药；体内研究结果显示，用本发明专利技术的修复方法，可成功修复骨缺损，在组织工程骨构建及骨缺损修复中有着良好的应用前景。

The application of mangiferin in the preparation of drugs to promote bone defect repair

The invention relates to a preparation of mangiferin in promoting the application of drugs for repairing bone defects in the traditional way, for the repair of bone host microenvironment lack of blood, the seed cells in hypoxia caused apoptosis, osteogenic effect and other issues, not only has a protective effect on seed cells using mangiferin, and can promote the osteogenic ability, combine bone repair strategies into bone cartilage system: mesenchymal stem in porous bone scaffolds to construct tissue engineering complex cells grown in vitro, then the chondrogenic differentiation medium for 2 weeks, then a mast cartilage differentiation medium repair implant defect after 2 weeks; mangiferin can be supported on porous bone scaffold materials, can also be the whole system of administration; in vivo study showed that the repair method of the invention, can successfully repair bone defect in The construction of tissue engineering bone and the repair of bone defect have a good prospect of application.

【技术实现步骤摘要】
芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用。
技术介绍
骨缺损、骨不连是骨科临床棘手的难题。由于自体骨和同种异体骨在来源、疾病传播以及形状大小等方面存在先天缺陷，组织工程骨作为一种优秀的替代策略近几年被广泛应用于临床。但由于传统组织工程骨基于膜内成骨的特点，其中心区不能有效血管化，限制了传统组织工程骨大小，使其不能有效用于修复大段骨缺损。为了克服上述缺点，近年来有学者提出基于软骨内成骨体系的组织工程骨，在构建基于软骨内成骨骨修复体系时，首先将种子细胞(如BMSCs)进行软骨诱导，然后移植于大段骨缺损处。但由于宿主微环境缺乏血运，种子细胞在缺氧环境中易引起凋亡，导致成骨效果不佳。因此寻找一种对种子细胞有保护作用的药物并能促进其成骨能力的药物是一种可行的策略。芒果苷是一种天然的清除自由基的抗氧化剂，其分子结构中的4个酚羟基具有亲电子能力，从而保护生物分子芒果苷作为一种天然化合物具有显著抗氧化应激作用。但是，未见芒果苷用于软骨内成骨体系的骨修复，减少种子细胞因缺氧微环境所产生的氧自由基，减少其凋亡，并促进骨修复效果的报道。
技术实现思路
为解决应用大块基于软骨内成骨体系修复大段骨缺损时，其种子细胞在进入骨缺损区时，容易由于缺氧二产生大量活性氧(ROS)，导致细胞凋亡，本专利技术提供一种采用芒果苷保护种子细胞凋亡，同时促进软骨内成骨修复效果的方法，以避免大段骨缺损修复时，种子细胞过早凋亡和修复效果不理想的难题。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用，具体方法为将间充质干细胞种植于大段骨缺损材料上，在体外对其进行成软骨分化诱导3D培养2周，继而进行成肥大化软骨分化诱导培养2周，然后将上述修复复合体植入骨缺损处，可以使用芒果苷增强骨修复效果。优选的，所述芒果苷在制备基于软骨内成骨体系中促进骨缺损修复的药物中的应用。优选的，所述芒果苷在制备减少缺氧导致的间充质干细胞活力降低或减少间充质干细胞凋亡的药物中的应用。优选的，所述芒果苷在制备促进间充质干细胞分化为软骨细胞的药物中的应用；软骨方向分化的标准为，细胞高表达转录因子Sox9，胶原蛋白Col2a1。优选的，所述芒果苷在制备促进间充质干细胞分化为肥大化细胞的药物中的应用；肥大软骨方向分化的标准为，细胞高表达Runx2、Col10a1和Mmmp13基因。优选的，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。优选的，所述芒果苷为芒果苷单体或由载药递送系统装载的芒果苷单体。优选的，所述载药系统为纳米缓释微球或将芒果苷负载于多孔骨修复支架上。优选的，所述多孔骨修复支架为脱钙/非脱钙骨基质，或人工合成的用于骨修复的多孔支架材料。优选的，所述芒果苷的化学式为C19H18O11。本专利技术中，所述芒果苷使用量至少为5mg/kg。本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用，在有效剂量内，芒果苷对骨髓间充质干细胞(BMSCs)、软骨细胞无毒性；在浓度范围内能够抑制BMSCs因缺氧引起的凋亡。芒果苷在有效剂量内能够通过促进AMPK通路促进BMSCs，从而促进BMSCs向软骨和肥大软骨方向分化。在用于基于软骨内成骨体系的骨修复时，可以增强种子细胞的存活能力，增强成骨效果，从而在组织工程骨构建及骨缺损修复中有着良好的应用前景。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为芒果苷能够浓度依赖性抑制种子细胞凋亡(A：芒果苷结构式；B：CCK-8检测细胞活力；C：流式细胞术检测细胞凋亡情况)。图2为芒果苷在体外能够促进BMSCs向软骨方向分化检测结果(A：免疫组化结果；B：荧光定量结果；C：Westernblot检测结果)。图3为芒果苷在体外能够促进BMSCs向肥大软骨方向分化(A：免疫组化结果；B：荧光定量结果；C：Westernblot检测结果)。图4为芒果苷通过促进AMPK通路激活BMSCs自噬(A：Westernblot检测结果B：加入芒果苷后，自噬相关基因Westernblot检测结果；C：加入AMPK抑制剂后，自噬相关基因Westernblot检测结果；D：加入芒果苷后，诱导线粒体自噬共聚焦照相结果；E：加入自噬抑制剂后，14天和28天软骨内成骨相关标志基因Westernblot检测结果)。图5体内实验显示芒果苷促进软骨内成骨修复体系对骨缺损的修复。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例1、骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养采用肝素处理注射器于无菌条件下抽取人骨髓2～3mL，立即加至盛有等量DMEM低糖培养基的离心管中，迅速轻轻吹打制成细胞悬液，所得细胞悬液沿管壁轻轻加至预置等体积淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心20min，收集白膜层的单个核细胞于另一离心管中，用DMEM洗涤(1000r/min离心5min)两次，弃上清，细胞用含15％胎牛血清的DMEM-L完全培养基重悬后，以1×106/mL细胞密度接种于培养瓶中，记为原代，置37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，每隔3天换液，换液后于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征，待细胞接近融合时用0.25％胰蛋白酶消化，以1∶2比例传代。待上述培养的骨髓间充质干细胞融合至70％左右时，于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征，结果显示，细胞生长状态良好，形态均一，大部分细胞为呈宽大多角形或扁平状的成熟间充质干细胞。实施例2、芒果苷能够减少缺氧导致的BMSCs细胞活力降低将上述BMSCs按照5×103个/cm2的密度接种96孔板和6孔板。24h后弃掉培养基换成CoCl2溶液，处理12h。分别加入芒果苷浓度为1μM、5μM、10μM和20μM溶液200μM处理。24h后使用CCK-8检测细胞活力，使用流式细胞术检测细胞凋亡，结果如图1所示。结果显示芒果苷浓度大于20μM时在体外能够减少缺氧导致的细胞活力降低(p<0.05)，并减少BMSCs凋亡(p<0.05)。实施例3、芒果苷促进BMSCs促进软骨分化待上述培养的骨髓BMSCs融合至90％左右时，用质量分数0.25％的胰蛋白酶消化，再用不完全软骨诱导培养基(即DMEM高糖培养基中添加1％ITS，100mg/mL链霉素、100U/mL青霉素、100μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松)重悬并调整细胞密度至5.0×105/mL，所得细胞悬液按每个15mL离心管中0.5mL细胞悬液(2.5×105个细胞)进行分装，然后500g离心10min使细胞凝集成团，离心结束后无需弃上清或重悬细胞，将离心管轻柔地放置于恒温培养箱中，静置24h，然后更换为完全软骨诱导培养基(即DMEM低糖培养基中添加10ng/mLTGF-β3，1％ITS，100mg/mL链霉素、100U/mL青霉素、50μg/mL维生素C、40μg/mL脯氨酸和100nM地塞米松)，每个离心管加入完全软骨诱导培养基500μL，换液完成后轻弹离心管壁使细胞团处于自由悬浮状态，之后每隔3天换液，培养14天。相应分组如下：组1：无软骨诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.芒果苷在制备促进骨缺损修复的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芒果苷在制备基于软骨内成骨体系中促进骨缺损修复的药物中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芒果苷在制备抗软骨细胞减少缺氧导致的间充质干细胞活力降低或减少间充质干细胞凋亡的药物中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芒果苷在制备促进间充质干细胞分化为软骨细胞的药物中的应用。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述芒果苷在制备促进间充质干细胞分化为肥大化细胞的药物中的应用。6.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：白赟，董世武，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50