一种快速分析甲壳动物血淋巴细胞类群和数量的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于快速检测多种常见甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法。其原理为凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等甲壳动物血淋巴细胞内的颗粒结构可以作为分类参考，利用具有图像辅助功能的多维全景分析仪，以样点所在分区和辅助图像为依据，可甄别不同类群血淋巴细胞并自动完成统计分析。本方法的特点为:不用染色，避免常规染色及显微镜观察等述诸多人工环节的影响；利用高灵敏度检测器的自动化信号分析，重复性好；多维全景检测仪具有高通量检测能力，数万细胞样点的结果可靠性也远超过人工计数；微量检测所用试剂耗材很少，成本低。本方法不但可用于科学分析、日常监测，还可为分类收集血淋巴细胞提供技术支持，有巨大应用价值。

A method for rapid analysis of the blood lymphocyte groups and numbers of crustaceans and its application

The present invention discloses a method for rapid detection of the species and quantity of the blood lymphocytes of a variety of common crustaceans. The principle of particle structure of Litopenaeus vannamei, crayfish and other crustaceans of Eriocheir sinensis animal lymphocytes can be classified as reference, using the multi-dimensional panoramic analyzer has the auxiliary function of the image, to sample partition and auxiliary image as the basis, can identify different groups of blood lymphocytes and automatic statistical analysis. The characteristics of this method are: no staining, avoid the influence of staining and microscopy, the many artificial links; analysis of the use of automatic signal detector of high sensitivity, good repeatability; multidimensional panorama detector with high throughput detection capability, the reliability of the result of tens of thousands of cell samples is far more than the manual counting; trace detection for reagents and consumables rarely, low cost. This method not only can be used in scientific analysis, daily monitoring, but also can provide technical support for the classification and collection of blood lymphocytes. It has great application value.

【技术实现步骤摘要】
一种快速分析甲壳动物血淋巴细胞类群和数量的方法及应用本专利申请由天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室完成，得到国家自然科学基金（31472299），天津市应用基础与前沿技术研究计划（15JCZDJC33800），天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金(TJAE2015005)，“十二五”农村领域国家科技计划课题（2011BAD13B04）的资助。
本专利技术属于检测
，以胞内颗粒特征为基础，结合多维全景检测仪的图像辅助分析功能对凡纳滨对虾、克氏原螯虾及中华绒螯蟹等常见甲壳动物的血淋巴细胞进行准确分类和比例分析，建立一种适用于依据胞内颗粒差异进行分类的高效血象检测方法。
技术介绍
甲壳动物血淋巴的功能与脊椎动物的血液类似，其中的各类细胞承担着重要的免疫职责，因此对各类血淋巴细胞进行准确分类、统计是开展科学研究及客观评价健康状况的重要支撑。人类等高等动物的血细胞研究技术十分成熟，通过各种单克隆抗体不但能够对每类细胞进行辨识区分，还能精确分析细胞所处的不同分化时期以及生理状态，因此，各种特异性抗体的生产是血细胞研究的重要保障。反观甲壳动物，专用抗体的缺乏成了制约血淋巴研究的瓶颈。单克隆抗体的淘选有赖于足量纯化的抗原性物质的制备，就甲壳动物血淋巴而言，需要辨识和分离出来足量的各类细胞。从19世纪开始，国内外学者就利用光镜染色、电镜切片、组织化学等技术对虾蟹等甲壳动物的血淋巴进行分类研究。但由于都是基于不同研究者的人工观察和判定，因此所描述的分类特征和判定依据不尽相同，迄今对甲壳动物血淋巴细胞的分类尚存在争议。Cornick等（1978）根据细胞内所含颗粒的大小、与染料的亲和性以及折光性，将鳌龙虾血细胞划分为前透明细胞、透明细胞、嗜伊红颗粒细胞和嫌色细胞四类。Hose等（1990）对美洲鳌龙虾、短沟龙虾和大弯吻蟹的血细胞形态进行细胞化学性质研究，并结合电镜和光镜结果，将甲壳类血细胞分为透明细胞、大颗粒细胞和小颗粒细胞。叶燕玲等（1993）和于建平（1993）分别对中国对虾和日本对虾血淋巴细胞进行了分类研究，并将其分为透明（或无颗粒）细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。陈平等（1998）则通过电镜观察将中国对虾、日本对虾、长毛对虾和草虾的血淋巴细胞分为四类：透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞和“浆样细胞”。战文斌等（2001）收集中国对虾混合血淋巴细胞免疫小鼠后筛选到三株单克隆抗体，并利用自制单克隆抗体对中国对虾的血细胞分类进行了初步尝试，结果也仅估计透明细胞占比约60%，小颗粒细胞占比约30%，而且未能给出其它种类细胞类型和所占比例的统计。孙敬锋等（2008）尝试用流式细胞仪对三种虾类血细胞进行分类，但只能区分出三类细胞，而且类群边界不甚清晰。有鉴于此，冼建安等（2015）不对血淋巴细胞加以分类，而是以流式细胞仪直接测量混合血淋巴细胞总数，并据此判断健康状况。由此可见，虽然在甲壳动物血淋巴细胞分类方面有很多前期研究，但都因没有适合的仪器和普遍适用的方法而进展缓慢，所以迫切需要一种新的快速、准确、重复性好的自动化分类统计方法。具有图像辅助功能的多维全景检测仪可用于分析液流中的各种颗粒物质。对于细胞而言，可以把细胞大小、颗粒度等多种物理特征的测量结果与同时采集到的各个通道的显微图像结合，从新的视角和更多的参考维度对各类细胞之间的差异加以区分，具有“眼见为实”的巨大优势。常规流式细胞仪利用标记抗体等技术手段可以快速测量悬浮在液体中的分散细胞的一系列生物物理、生物化学特征参量，并可以通过预设的参量范围把特定类群的细胞从中分选出来。但是，由于缺乏图像参考，对于没有特殊标记的筛选物，只能通过上样-回收-分析的流程反复检测。在这一过程中，细胞不能重复使用，而且由于其缺乏对单个细胞的回收分析能力，而边界细胞和低丰度细胞的数量往往都很少，所以需要大量样品反复尝试。而这种试错操作却往往因为费时费力，且结果的重复性欠佳而被放弃。由于上述诸多因素的局限，利用常规流式细胞仪开展甲壳动物血淋巴细胞分析的研究一直处于尝试阶段，迄今未见有通用的方法及商业化的辅助检测产品报道。多维全景检测仪，把流式的高通量能力与各种新型的检测模式相结合，创造了一种新颖的分析平台，尤其是能够同步储存每个样点在每个检测通道的图像，使得边界细胞的划分变得简便易行，只需一次上样，即可随时定点查看每个细胞的各项检测信息，借助图像辨识结果调整不同细胞类群的分析参数和范围。“眼见为实”让结果更为精准，基于高灵敏检测器测得的数万样点的高通量统计分析结果也较以往缺乏统一评价标准的分类和有限人工计数更为可靠，为今后形成统一的规范和进一步开发商业产品提供了基础性的技术支撑。本专利技术针对凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等常见甲壳动物血淋巴细胞内具有明显颗粒状亚细胞结构的特征，结合全景检测仪图像辅助分析功能，建立了一种快速、准确、高通量的血淋巴细胞分类计数方法。微创采集10-100微升血淋巴，不用染色，即可把4类血淋巴细胞完全分开，且分群边界十分清晰（参见附图1）。本专利技术的分析结果是基于高灵敏度检测器对数万样点的准确测量，而且有原始图像佐证，因此精准、可靠；另外，本方法操作及其简便，借助高通量的进样模块，耗时很短，从样品采集到分析完成不超过一小时，如果连续批量作业，每小时可以检测15-30个样本。本专利技术以应用为目的，因此特别注重保证测量结果准确性的前提下，节约成本；本方法所用的试剂只有柠檬酸钠抗凝剂和PBS缓冲液等常规试剂耗材，同时由于是微创检测，因此用量也很少，每个样本检测成本不足1元。综上所述，本专利技术建立了一种操作简便，速度快，可靠性高，成本低的血淋巴细胞分类统计方法，可以对各类以胞内颗粒特征为分类依据的血淋巴细胞进行自动化分析。能够用于多种甲壳动物血象分析、养殖监测以及免疫学研究等领域；也可以作为技术支撑，服务于批量回收单一种类的细胞用于单克隆抗体的制备、筛选以及相关检测产品的研发，因此拥有广阔的市场前景。
技术实现思路
针对缺乏特异性抗体辅助分类的现状，本专利技术的方法利用多维全景分析仪检测细胞大小、颗粒度等物理特征的差异，并根据同步采集图像的佐证，对血淋巴细胞进行分类。为此，本专利技术公开了一种快速检测甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法，其特征在于以胞质颗粒的多少和复杂度差异为依据，结合多维全景分析仪的图像辅助功能，区分不同血淋巴细胞类群，对划分的各个类群细胞进行准确鉴定分析并自动完成分类计数和统计分析；按如下的步骤进行：（1）微创抽取10-1000微升血淋巴，用4%多聚甲醛室温固定5分钟，PBS重悬细胞，用70微米细胞筛过滤去除黏连细胞；（2）取20-200微升经上述处理的细胞样品，中流速连续采集30000个样点，以Intensity和Area为横、纵坐标作图即可把各类血淋巴细胞按照颗粒分布和复杂度区分为4个类群；所述的甲壳动物指的是：凡纳滨对虾、克氏原螯虾及中华绒螯蟹等。本专利技术优选的方法如下：（1）样品制备：根据采血量需要，使用微量进样器或一次性注射器吸取抗凝剂，从待测动物步足基部的血窦处抽取10-1000微升血淋巴，混匀后迅速移入固定液，室温固定5分钟；所述抗凝剂：0.14MNaCl、0.1M葡萄糖、10mMEDTA、30mM柠檬酸钠、26mM柠檬酸；所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法， 其特征在于以胞质颗粒的多少和复杂度差异为依据，结合多维全景分析仪的图像辅助功能，区分不同血淋巴细胞类群，对划分的各个类群细胞进行准确鉴定分析并自动完成分类计数和统计分析；按如下的步骤进行：（1）微创抽取10‑1000微升血淋巴，用4%多聚甲醛室温固定5分钟，PBS重悬细胞，用70微米细胞筛过滤去除黏连细胞；（2）取20‑200微升经上述处理的细胞样品，中流速连续采集30000个样点，以Intensity和Area为横、纵坐标作图即可把各类血淋巴细胞按照颗粒分布和复杂度区分为4个类群；所述的甲壳动物指的是：凡纳滨对虾、克氏原螯虾及中华绒螯蟹。

【技术特征摘要】
1.一种快速检测甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法，其特征在于以胞质颗粒的多少和复杂度差异为依据，结合多维全景分析仪的图像辅助功能，区分不同血淋巴细胞类群，对划分的各个类群细胞进行准确鉴定分析并自动完成分类计数和统计分析；按如下的步骤进行：（1）微创抽取10-1000微升血淋巴，用4%多聚甲醛室温固定5分钟，PBS重悬细胞，用70微米细胞筛过滤去除黏连细胞；（2）取20-200微升经上述处理的细胞样品，中流速连续采集30000个样点，以Intensity和Area为横、纵坐标作图即可把各类血淋巴细胞按照颗粒分布和复杂度区分为4个类群；所述的甲壳动物指的是：凡纳滨对虾、克氏原螯虾及中华绒螯蟹。2.权利要求1所述的检测方法，其特征在于：（1）样品制备：根据采血量需要，使用微量进样器或一次性注射器吸取抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张亦陈，胡锦丽，刘逸尘，晋伟，耿绪云，孙金生，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津,12