一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备菠萝汁；(2)配制天然聚阴离子多糖溶液；(3)分别调节菠萝汁、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将菠萝汁与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使菠萝汁中的菠萝蛋白酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成菠萝蛋白酶‑聚阴离子多糖复合物沉淀；(4)离心收集菠萝蛋白酶‑聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到菠萝蛋白酶制剂。本发明专利技术采用聚阴离子多糖和菠萝蛋白酶，通过静电相互吸引作用产生沉淀的原理来达到菠萝蛋白酶分离和制剂的目的，该制剂既可以保持菠萝蛋白酶在贮藏加工过程中的稳定性，还能克服菠萝蛋白酶对热敏感、易氧化的缺点，并具有良好的缓释和控释性能。

【技术实现步骤摘要】
一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法
本专利技术属于蛋白酶制剂
，具体涉及一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法。
技术介绍
菠萝蛋白酶是从菠萝皮和菠萝茎中提取得到的一种蛋白酶，菠萝蛋白酶的生产可以解决菠萝产业中大量废料被丢弃造成的环境污染和资源浪费问题，还可使菠萝产品高值化利用。菠萝蛋白酶属于木瓜酶系，根据分离提取部位的不同分为茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.32)和果菠萝蛋白酶(EC3.4.22.33)，两者的分子量分别为33kDa和28kDa，等电点分别为9.5和4.6，商业用菠萝蛋白酶大多为茎酶。菠萝蛋白酶在制药和食品行业中应用范围广泛。在医药领域中，因为菠萝蛋白酶具有抗血栓、抗水肿、抗炎等作用，其可用于溃疡和烧伤创面坏死组织的清除。在食品工业领域中，菠萝蛋白酶广泛应用于肉质的嫩化、啤酒澄清、干酪生产和水解蛋白等。目前，分离纯化菠萝蛋白酶的工业方法主要有高岭土吸附法、单宁沉淀法和超滤浓缩法等。高岭土吸附法所得产品酶活性较高，但生产工艺较为复杂，设备和原材料消耗多，酶活回收率低，污染环境，环保投资较大；单宁沉淀法操作简单，但是专一性较差，酶活回收率和酶活性较低，且单宁是一种有毒物质，会对环境造成污染；超滤浓缩法操作简单，酶活损失和环境污染较少，但是其专一性较差，菠萝蛋白酶制品中含有的杂蛋白较多，难以满足使用要求。通过固定化技术制备菠萝蛋白酶以提高其稳定性也是现有技术中常用的一种手段，固定化酶与游离酶相比，具有热稳定性高、保存稳定性好、抵抗性强、不易水解以及对变性剂耐受性好等特性，因而固定化技术成为生物酶得到广泛而有效利用的重要手段。固定化酶常用的包埋材料有很多，其中海藻酸钠最为常见。高尚欣等(“海藻酸钠-壳聚糖共固定化菠萝茎蛋白酶的研究”，高尚欣等，食品工业科技，第32卷第5期，第209-211页，2011年)用移液器将菠萝茎蛋白酶缓慢注入到海藻酸钠溶液中，然后用七号针头注射器将海藻酸钠-酶混合液以5cm高度注入含CaCl2的壳聚糖溶液中形成光滑微球，这种以海藻酸钠、壳聚糖为材料共固定化制备获得的菠萝茎蛋白酶可重复使用，其最适反应温度和热稳定性等酶学特性也得到了改善。张琛等(“海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶”，张琛等，生物加工工程，第7卷第6期，第31-34页)提出以海藻酸钠为载体固定化菠萝蛋白酶，提高了菠萝蛋白酶的最适pH及对碱性环境和温度的稳定性。以上文献利用可溶性海藻酸钠与二价金属离子Ca2+反应可形成微球的原理对菠萝蛋白酶进行包埋，能够在温和条件下实现酶的固定化，有助于保持酶的生物活性。该固定化技术中，酶与海藻酸钠之间是否发生相互作用对包埋没有影响；但是，钙化的海藻酸钠微球粒径大、稳定性差，容易在多离子作用或在钙离子扩散而钾、钠离子大量聚集时变软出现“漏酶”现象；并且，固定化过程在酶分离工序完成后进行，需要在原有的酶生产流程上添加额外的工艺，造成固定化技术成本较高；而且，通过固定化技术包埋制备的酶制剂在使用时，由于酶被包埋在基质中而无法实现酶的缓释和控释，因此只能应用于具有良好扩散性的液体食品中，无法在粘度较大的液体及固态食品中发挥作用。专利技术专利CN102108352A公开了一种新的菠萝蛋白酶的固定化方法，该专利技术以壳聚糖为载体，以戊二醛为交联剂，将壳聚糖制备成微球，然后利用壳聚糖微球固定菠萝蛋白酶，既提高了载体的机械强度，也有利于提高固定化酶的载酶量、酶活力及酶回收率，同时也使酶与水解产物易于分离。但是，该专利技术采用戊二醛作为交联剂，戊二醛常用做杀菌剂，对眼镜、皮肤和粘膜具有强烈的刺激且不易去除，由此影响了该专利技术在食品工业中的应用；该专利技术需要在菠萝蛋白酶的分离纯化工艺基础之上采用额外的工艺；并且，由于该专利技术的酶制剂无法实现酶的缓释和控释，这也同样限制了该专利技术制备的酶制剂在粘度较大的液体及固态食品中的应用。因此，探索一种操作步骤简单、成本低廉、无污染、稳定性高且具有缓释和控释功能的菠萝蛋白酶制剂及其制备方法，对于扩大菠萝蛋白酶的应用范围具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中菠萝蛋白酶制剂存在的上述问题，本专利技术提供了一种新型菠萝蛋白酶制剂及其制备方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现：一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将菠萝皮清洗、榨汁、过滤，调节滤液pH值后，加入壳聚糖溶液，搅拌混合均匀，4℃冰箱放置24h，离心后取上清液得菠萝汁；(2)配制天然聚阴离子多糖溶液，于4℃过夜充分水合；(3)分别调节菠萝汁、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将菠萝汁与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使菠萝汁中的菠萝蛋白酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀；(4)离心收集菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到菠萝蛋白酶制剂。进一步，所述步骤(1)中用柠檬酸或苹果酸溶液调节滤液pH值至2.5-4.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液；所述步骤(1)中在10000r/min条件下离心20min，取上清液得到澄清的菠萝汁。进一步，所述步骤(2)中的天然聚阴离子多糖包括海藻酸钠、果胶、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、黄原胶中的一种或几种混合物。进一步，所述步骤(3)中采用柠檬酸或苹果酸溶液分别将菠萝汁和聚阴离子多糖溶液pH值调至2.5-4.0；所述步骤(3)中将稀释至10％的菠萝汁与0.5％-2％(w/v)的聚阴离子多糖溶液等体积充分混合，于4-45℃下搅拌反应10-30min。进一步，所述步骤(4)中采用4000r/min离心20min，收集菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀。所述步骤(4)的干燥方法为冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥中的一种。进一步，所述步骤(4)中菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀中的酶活回收率为76.7％-83.4％，在离心的上清液中酶活回收率为14.5％-20.6％，酶活损失率为2.1％-2.7％。进一步，根据本专利技术的新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法制备得到的菠萝蛋白酶制剂。进一步，所述菠萝蛋白酶制剂的最适反应温度为55-65℃；所述菠萝蛋白酶制剂的最适反应pH为6.6-7.2；所述菠萝蛋白酶制剂在70℃下加热2h后，剩余酶活力为62％-73％。进一步，所述菠萝蛋白酶制剂在碱性条件下30min内会释放出所有的菠萝蛋白酶；所述菠萝蛋白酶制剂在pH5.0及以上的酸性条件下2h内会释放出所有菠萝蛋白酶；所述菠萝蛋白酶制剂在pH2.5-4.0时无酶释放；食盐的存在会加速酶的释放。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益技术效果是：(1)本专利技术能够将菠萝产业中大量被丢弃的废料制备成菠萝蛋白酶制剂，使菠萝产品高值化利用，解决了环境污染和资源浪费的问题。(2)相对于现有技术中采用固定化技术来包埋酶，本专利技术利用菠萝蛋白酶在等电点以下带正电，可与带负电荷的聚阴离子多糖发生静电相互作用形成聚电解质复合物，使两者在复合物中均匀分布，以保护菠萝蛋白酶中巯基、氨基、色氨酸残基和组氨酸残基免受环境因素影响，使酶的贮藏稳定性得到了显著的提高。目前，还没有发现采用聚阴离子多糖与菠萝蛋白酶形成聚电解质复合物制剂的研究报道。(3)相对于海藻酸钠固定化制备的菠萝蛋白酶，通过本专利技术制备的菠萝蛋白酶粒径小，安全性强，酶稳定性高，不仅可用于液体食品，还可用于粘度较大的液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将菠萝皮清洗、榨汁、过滤，调节滤液pH值后，加入壳聚糖溶液，搅拌混合均匀，4℃冰箱放置24h，离心后取上清液得到菠萝汁；(2)配制天然聚阴离子多糖溶液，于4℃过夜充分水合；(3)分别调节菠萝汁、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将菠萝汁与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使菠萝汁中的菠萝蛋白酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成菠萝蛋白酶‑聚阴离子多糖复合物沉淀；(4)离心收集菠萝蛋白酶‑聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到菠萝蛋白酶制剂。

【技术特征摘要】
1.一种新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将菠萝皮清洗、榨汁、过滤，调节滤液pH值后，加入壳聚糖溶液，搅拌混合均匀，4℃冰箱放置24h，离心后取上清液得到菠萝汁；(2)配制天然聚阴离子多糖溶液，于4℃过夜充分水合；(3)分别调节菠萝汁、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将菠萝汁与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使菠萝汁中的菠萝蛋白酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀；(4)离心收集菠萝蛋白酶-聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到菠萝蛋白酶制剂。2.根据权利要求1所述的新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中用柠檬酸或苹果酸溶液调节滤液pH值至2.5-4.0，加入等体积的1％壳聚糖溶液；所述步骤(1)中在10000r/min条件下离心20min，取上清液得到澄清的菠萝汁。3.根据权利要求1所述的新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的天然聚阴离子多糖包括海藻酸钠、果胶、羧甲基纤维素钠、阿拉伯胶、黄原胶中的一种或几种混合物。4.根据权利要求1所述的新型菠萝蛋白酶制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用柠檬酸或苹果酸溶液分别将菠萝汁和聚阴离子多糖溶液pH值调至2.5-4.0；所述步骤(3)中将稀释至10％的菠萝汁与0.5％-2％(w/v)的聚阴离子多糖溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄国清，肖军霞，孙欣，郭丽萍，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37