一种马铃薯S病毒的RT‑LAMP检测引物及其可视化检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种马铃薯S病毒的RT‑LAMP检测引物及其可视化检测方法。所述检测引物组，包括如下二个引物对：外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP，核苷酸序列如SEQ NO.1‑4所示。通过RNA提取、反转录cDNA、LAMP扩增进行检测。本发明专利技术针对马铃薯S病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，为马铃薯S病毒的防治提供可靠的技术依据。

【技术实现步骤摘要】
一种马铃薯S病毒的RT-LAMP检测引物及其可视化检测方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种马铃薯S病毒的RT-LAMP检测引物及其可视化检测方法。
技术介绍
马铃薯S病毒(PotatovirusS，PVS)是侵染我国马铃薯的主要病毒，在我国的马铃薯病毒检出率中最高，严重时可导致马铃薯减产10％-20％，甚至绝产，造成巨大的经济损失。在田间生产中，特别是马铃薯种薯繁殖过程中，马铃薯植株一旦感染马铃薯病毒，造成马铃薯种薯质量下降，种性退化。因此在马铃薯生产过程中，病毒检测尤为重要，一旦发现疑似病株，经检验为阳性的植株应立刻拔除，防治蚜虫和粉虱传播蔓延。目前，马铃薯病毒尚无特别有效的化学防治方法，经过茎尖脱毒技术培育无病毒苗成为防治马铃薯病毒的根本措施，在无毒苗培育过程中，高效、灵敏、快速的病毒检测体系及方法显得尤为重要。因此，研发出马铃薯S病毒的早期快速诊断技术，对保障马铃薯产业健康生产至关重要。目前，病毒检测主要有传统检测及分子生物学检测法等。传统检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用。环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)采用4～6条特异引物和DNA链置换聚合酶(BstDNApolymerase),快速对靶基因进行恒温扩增的一种高效的方法，该方法具有操作简便、快速灵敏、特异性强，可用肉眼直接观察检测结果的可视化检测方法，同时不需要特殊的仪器设备，适合在基层生产部门推广应用。由于LAMP反应具有简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道极少，用于马铃薯S病毒的检测国内外均未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种马铃薯S病毒的RT-LAMP检测引物及其可视化检测方法，可用于开发适合田间马铃薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障马铃薯健康生产。本专利技术是这样实现的：一种马铃薯S病毒的RT-LAMP检测引物组，包括如下二个引物对：外引物F3：5'-GCGGTTTTCAATCGATGAGC-3'外引物B3：5'-ACAGTCCCTGCTGGATCT-3'内引物FIP：5'-AAGTCCAGCGATGTCAGCAGTG-TCCGATCTGTGTCCAACAAC-3'内引物BIP：5'-GGTCCCCACTGAGCACGTTG-ACTCACGCTTGCACACATG-3'。利用上述的检测引物组进行马铃薯S病毒的RT-LAMP可视化检测方法，包括以下步骤：(1)RNA提取：对样本进行处理，抽提样本RNA；(2)反转录cDNA：将经步骤(1)处理所得的RNA反转录成cDNA(3)LAMP扩增：以经步骤(2)提取的cDNA为模板，按照RT-LAMP反应体系进行检测。进一步地，步骤(3)所述RT-LAMP反应体系中包含Tris-HCl、(NH4)2SO4、MgSO4、KCl、甜菜碱、dNTPs、BstDNA聚合酶、FIP和BIP、F3和B3、钙黄绿素、氯化锰、Tween-20。更优选地，步骤(3)所述RT-LAMP反应体系中各成分的终浓度分别为：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、8.8mMMgSO4、50mMKCl、0.2mM甜菜碱、dNTPs1.4mmol·L-1、BstDNA聚合酶8U、FIP和BIP各1.6μmol·L-1、F3和B3各0.2μmol·L-1、钙黄绿素50μmol·L-1、氯化锰500μmol·L-1、Tween-200.1wt％，模板50-100ng，其余用无菌双蒸水补充至反应体系总体积为25μl。所述RT-LAMP的反应条件为在62℃温育60min，85℃灭活10min，冰上终止反应。反应可在普通的水浴锅中进行，不需要昂贵的专用PCR仪就能反应，反应终止后直接用肉眼观察结果，方便、实用。进一步地，取5μLRT-LAMP反应产物以2％琼脂糖凝胶(荧光染料)为电泳支持介质，用紫外透射仪观察RT-LAMP产物为特殊的阶梯状条带，而阴性对照不产生条带；反应结束后，阳性产物颜色变为绿色，阴性对照为橙色。本专利技术在LAMP反应前加入钙黄绿素和氯化锰，反应结束后，显色为荧光绿色的为阳性，显色为橙色的为阴性，有效避免反应后再加入SYBRGREENI造成的污染问题，实现可视化检测。本专利技术具有如下优点：本专利技术所建立的RT-LAMP技术检测马铃薯S病毒的方法，与常规PCR方法相比，在保持PCR技术优点的基础上，LAMP方法不需要热循环设备，节省了升降温环节所用的时间，更加省时，可以在60min内完成扩增反应。同时，由于LAMP技术使用4～6条引物，与PCR技术相比具有相当或更高的灵敏度，进一步增强了反应的特异性。同时在恒温扩增过程中加入了钙黄绿素(Calcein)，在反应结束后不用打开盖子就能直接观测结果，使检测过程更加快捷方便，避免污染产生假阳性，因此该方法特别适合在基层中应用。本专利技术针对马铃薯S病毒建立的环介导等温扩增技术具有扩增快速高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，有较高的应用价值，在基层和现场检测中有很好的应用前景。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1为本专利技术中实施例一的RT-LAMP检测结果图；其中M:DL2000DNAmarker，+：LAMP阳性产物，-：阴性对照。图2为本专利技术中实施例二的2％琼脂糖凝胶电泳图；M:DL2000DNAmarker；1-6分别表示RNA稀释浓度为1；10-1；10-2；10-3；10-4；10-5。图3为本专利技术中实施例三的2％琼脂糖凝胶电泳图；M:DL2000DNAmarker；1-5分别为PVS、PVX、PVY、PVA、CMV。具体实施方式实施例一本专利技术的一种马铃薯S病毒的RT-LAMP可视化检测方法，根据GenBank公布的PVS较保守的CP基因序列为靶标基因应用LAMP引物设计软件primerexplorer4.0(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，得到针对6个区域的4条特异性引物。应用DNA链置换聚合酶(BstDNApolymerase),在恒温条件下快速对靶基因进行RT-LAMP扩增，最后将反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析，DNA荧光染料检测、克隆测序比对。其中，各引物对具体为：F3：5'-GCGGTTTTCAATCGATGAGC-3'B3：5'-ACAGTCCCTGCTGGATCT-3'FIP：5'-AAGTCCAGCGATGTCAGCAGTG-TCCGATCTGTGTCCAACAAC-3'BIP：5'-GGTCCCCACTGAGCACGTTG-ACTCACGCTTGCACACATG-3'具体步骤如下：步骤100：根据GenBank公布的PVS较保守的CP基因序列为靶标基因应用LAMP引物设计软件primerexplorer4.0(http：//primerexplorer.jp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马铃薯S病毒的RT‑LAMP检测引物组，其特征在于：包括如下二个引物对：外引物F3：5'‑GCGGTTTTCAATCGATGAGC‑3'外引物B3：5'‑ACAGTCCCTGCTGGATCT‑3'内引物FIP：5'‑AAGTCCAGCGATGTCAGCAGTG‑TCCGATCTGTGTCCAACAAC‑3'内引物BIP：5'‑GGTCCCCACTGAGCACGTTG‑ACTCACGCTTGCACACATG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种马铃薯S病毒的RT-LAMP检测引物组，其特征在于：包括如下二个引物对：外引物F3：5'-GCGGTTTTCAATCGATGAGC-3'外引物B3：5'-ACAGTCCCTGCTGGATCT-3'内引物FIP：5'-AAGTCCAGCGATGTCAGCAGTG-TCCGATCTGTGTCCAACAAC-3'内引物BIP：5'-GGTCCCCACTGAGCACGTTG-ACTCACGCTTGCACACATG-3'。2.一种利用权利要求1所述的检测引物组的马铃薯S病毒的RT-LAMP可视化检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)RNA提取：对样本进行处理，抽提样本RNA；(2)反转录cDNA：将经步骤(1)处理所得的RNA反转录成cDNA；(3)LAMP扩增：以经步骤(2)提取的cDNA为模板，按照RT-LAMP反应体系进行检测。3.根据权利要求2所述的马铃薯S病毒的RT-LAMP可视化检测方法，其特征在于：步骤(3)所述RT-LAMP反应体系中包含Tr...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤浩，李华伟，罗文彬，纪荣昌，许泳清，刘中华，邱永祥，张鸿，李国良，林赵淼，邱思鑫，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35