一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提供的基因CBL3通过在烟草中过量表达，使得烟草抵抗盐胁迫的能力得到大幅度提升，本申请提供的CBL3基因具有很好的抗盐作用。

【技术实现步骤摘要】
一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用。
技术介绍
表达植物类钙调神经磷酸酶B亚基蛋白(calcineurinB-likeprotein，CBL)家族基因在逆境响应过程中具有重要功能，目前已经从许多植物(拟南芥，甜瓜，林烟草等)中克隆到这个家族基因(徐江等2006；刘明毓等2015；董红连，2015)。拟南芥中CBL1功能缺失突变体对铝敏感(Osena,2017),林烟草CBL10能响应高盐，低钾，高温和干旱的生理过程。西兰花中克隆到13个CBL基因，其中CBL10参与盐胁迫反应，目前，普通烟草中不同CBL基因的功能未知。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用。本专利技术提供的基因CBL3通过在烟草中过量表达，使得烟草抵抗盐胁迫的能力得到大幅度提升，本申请提供的CBL3基因具有很好的抗盐作用。本专利技术提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种参与烟草盐胁迫反应的蛋白CBL3，所述蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO.2所示序列和终止子。本专利技术还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的克隆载体，所述克隆载体包括权利要求1所述基因和pMD19-T载体。本专利技术还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的表达载体，所述表达载体包括权利要求1所述基因和PBI121载体。本专利技术还提供了上述技术方案所述基因或上述技术方案所述蛋白在烟草抵抗盐胁迫中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述克隆载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述表达载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。本专利技术提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用。本专利技术提供的基因CBL3通过在烟草中过量表达，使得烟草抵抗盐胁迫的能力得到大幅度提升，本申请提供的CBL3基因具有很好的抗盐作用。附图说明图1为本专利技术实施例1提供的CBL3基因的电泳图；图2为本专利技术实施例1提供的转基因烟草表达量检测结果图；图3为本专利技术实施例1提供的转基因烟草水培盐处理表型检测结果图；图4为本专利技术实施例1提供的转基因烟草土壤盐处理表型检测结果图；图5为本专利技术实施例1提供的叶绿素含量测定结果图；图6为本专利技术实施例1提供的过氧化物酶(POD)含量测定结果图；图7为本专利技术实施例1提供的脯氨酸含量测定结果图；图8为本专利技术实施例1提供的丙二醛含量测定结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述CBL3片段长度为669bp。本专利技术通过特异引物的设定，实现CBL3基因的扩增和定量检测，所述特异引物的序列如表1所示，其中引物NtCBL3-F/R用于扩增全长目的基因cds，引物NtCBL3Q-F/R用于定量检测CBL3目的基因的表达量，引物18SF/R是在检测CBL3目的基因表达量时的内参18S的定量引物。本专利技术所述定量检测方法优选为采用荧光定量PCR，本专利技术对所述荧光定量PCR的检测没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的定量检测条件参数即可。本专利技术引物的设计优选参照GenBank收录的CBL序列，登录号是LOC104211231。表1引物列表本专利技术对所述CBL3基因的扩增模板没有特殊的要求，采用基因扩增常用模板即可，如烟草总RNA。本专利技术对烟草总RNA的提取方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的总RNA提取试剂盒进行提取即可。本专利技术所述CBL3扩增的反应程序优选为：95℃预变性5min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min；35个循环。本专利技术对所述CBL3基因的扩增反应体系没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PCR扩增体系即可。本专利技术还提供了一种参与烟草盐胁迫反应的蛋白CBL3，所述蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO.2所示序列和终止子。本专利技术还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的克隆载体，所述克隆载体包括权利要求1所述基因和pMD19-T载体。本专利技术对所述pMD19-T载体的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的pMD19-T载体的市售产品即可。本专利技术对CBL克隆载体的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的克隆载体构建方法即可，如16℃连接过夜，本专利技术所述连接产物优选转化大肠杆菌DH5α进行克隆，随后优选在涂有氨苄青霉素的LB平板上，采用菌落PCR进行阳性克隆的筛选。本专利技术还提供了一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的表达载体，所述表达载体包括权利要求1所述基因和PBI121。本专利技术对所述CBL3表达载体的构建方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的织物表达载体构建方法进行即可。本专利技术得到表达载体后，优选采用农杆菌介导法进行烟草的遗传转化，本专利技术所述烟草的品种优选为烟草K326。本专利技术还提供了上述技术方案所述基因或上述技术方案所述蛋白在烟草抵抗盐胁迫中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述克隆载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。本专利技术还提供了上述技术方案所述表达载体在烟草抵抗盐胁迫中的应用。下面结合具体实施例对本专利技术所述的一种参与烟草盐胁迫反应的基因、蛋白及其应用做进一步详细的介绍，本专利技术的技术方案包括但不限于以下实施例。实施例11、基因克隆取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA，进一步采用Primer5.0软件设计引物对cDNA进行PCR扩增。扩增目的基因检测结果如图1，片段长度约为700bp，目的片段纯化后与pMD19-T载体16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，随后在涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，采用菌落PCR检测阳性克隆。检测后随机选取3个独立的阳性克隆送生物技术公司进行测序，基因序列如SEQIDNO.1所示。2、目的基因连接表达载体将上述转化好的T-载体与表达载体PBI121分别进行双酶切(酶切位点为：XbaⅠ和SmaⅠ)，回收目的基因和表达载体PBI121，然后用连接酶连接，将连接后的重组载体转入大肠杆菌DH5α的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR扩增、也可挑取单菌落扩繁、提取质粒进行酶切来检测是否构建成功。3、冻融法转化农杆菌和PCR检测取100μL感受态细胞，室温融化后加入10μL构建好的重组质粒DNA(PBI121-CBL3)，混匀后冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基，28℃慢速振荡培养4h，10000r/min离心1min集菌，弃上清，加入500μL含利福平和链霉素的LB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50μg/mL利福平、50μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的平板上，28℃避光培养约48h。待平板上长出的单菌落，直接用灭菌的牙签蘸取单菌落，在PCR体系中晃动几下后进行PCR扩增反应。1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物结果：若阴性对照(PCR反应不加模板)没有条带，但转录PCR产物有明亮且大小正确的条带，证明转化成功。4.农杆菌转化烟草方法4.1烟草无菌苗的培养和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种参与烟草盐胁迫反应的基因CBL3，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种参与烟草盐胁迫反应的蛋白CBL3，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO.2所示序列和终止子。3.一种参与盐胁迫反应的基因CBL3的克隆载体，其特征在于，所述克隆载体包括权利要求1所述基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立芹，鲁黎明，张雪微，卓维，陈倩，杨尚瑜，鲁逸飞，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51