一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L‑赖氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌的固定化方法，包括将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和MOPS的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。本发明专利技术还公开了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L‑赖氨酸的方法，包括发酵过程和补料过程，所述补料过程使用的营养成分为葡萄糖和硫酸铵。MOPS可以增强大肠杆菌在固定化材料表面的粘附效果；利用本发明专利技术的固定化大肠杆菌发酵L‑赖氨酸，L‑赖氨酸浓度由游离细胞发酵的90g/L提高至136g/L，重复发酵8批次仍能保持较高的L‑赖氨酸生产效率，平均每个批次最终L‑赖氨酸产量150g/L。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法
本专利技术涉及利用固定化细菌发酵生产L-赖氨酸，具体涉及一种大肠杆菌的固定化方法及利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法。
技术介绍
L-赖氨酸(Lysine)是脂肪族碱性氨基酸一种，化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL型(消旋)三种旋学异构体，人类和动物可吸收利用的只有L-型。L-赖氨酸是人和动物生长发育所需的八种必需氨基酸之一，它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS(DutchStateMijinen)法和日本的东丽法，合成法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题。1960年，日本首先采用微生物发酵法生产，微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。近年来，随着我国赖氨酸产量的高速增长，目前已成为世界最大的赖氨酸生产国。随着L-赖氨酸的应用价值不断被发现和拓宽,一方面通过菌种的筛选和分子育种不断发掘新的菌种和改良现有的菌种，另一方面工业化生产的方法也不断地改善和更新。发酵工艺上也主要是通过连续补料实现单批次的高产量，对于使用固定化技术进行连续多批次发酵鲜有报道。目前，应用于大肠杆菌的固定方法主要是凝胶包埋法，但包埋法所用到的凝胶颗粒机械性能差、对细胞毒性作用大，而且材料本身阻碍大分子底物和氧的扩散、使用过程中杂菌污染严重等问题大大限制了此法应用于大肠杆菌耗氧发酵生产L-赖氨酸。吸附法又称载体结合法,是利用带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和粘附力等作用,而使细胞固定在载体表面和内部的方法。该方法操作简单、成本较低，但所固定的大肠杆菌数目受所用载体种类及其表面积的限制。因为大肠杆菌与载体材料作用力小易脱落的缺点很少有人采用吸附法作为大肠杆菌的固定方法。
技术实现思路
专利技术目的：为了解决大肠杆菌和载体材料表面作用力弱、粘附力低和吸附固定化效果差，本专利技术提供了一种大肠杆菌的固定化方法；为了解决发酵底物葡萄糖对大肠杆菌生产L-赖氨酸的抑制效应，本专利技术还提供了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法。技术方案：本专利技术所述一种大肠杆菌的固定化方法，包括将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和3-吗啉丙磺酸的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。所述3-吗啉丙磺酸简写为MOPS。大肠杆菌的活化步骤如下：用无菌生理盐水洗下斜面保藏的大肠杆菌得到菌悬液，按照体积分数1％～5％的接种量将菌悬液接入含有30～100ml种子培养基的500ml三角瓶中进行培养，培养温度30～42℃，摇床转速150～250r/min，培养时间15～25h，使得培养液的OD值达到5。所述种子培养基的配方如下：蔗糖1～5g/L、蛋白胨1～6g/L、硫酸铵1～3g/L、酵母提取物1～4g/L、磷酸氢二钾0.2～0.6g/L、硫酸镁0.1～1g/L、硫酸亚铁0.01～0.1g/L、硫酸锰0.05～0.1g/L，溶剂为水，pH6.8～7.2。按照体积比为5～10％将所述活化的大肠杆菌接入所述培养基。所述培养基的配方如下：葡萄糖10～50g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水，所述培养基体积占所述容器体积的40％～60％。所述多孔网状材料包括棉纤维、木浆棉、合成海绵、聚酯纤维、细菌纤维素膜、生物过滤棉、丝瓜瓤或木屑，所述预处理包括将多孔网状材料裁剪成1～10cm3的方块，置于体积分数为50％～90％的乙醇水溶液中室温浸泡1～3h，然后用水清洗3～5次；所述多孔网状材料与所述培养基的比例为3～15g:1L。优选地，所述多孔网状材料包括合成海绵或丝瓜瓤；最优选地，所述多孔网状材料为合成海绵；所述多孔网状材料与所述培养基的比例为9～12g:1L所述3-吗啉丙磺酸与所述培养基的比例为50～150mM:1L。优选地，所述3-吗啉丙磺酸与所述培养基的比例为100～125mM:1L。所述固定化培养的温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌速率为100～1000rpm，溶解氧DO≥25％，培养时间为15～25h；保持pH6.0～7.5使用氨水调控。优选地，所述固定化培养的温度为35～37℃，pH为6.5。本专利技术还提供了一种利用上述固定化方法制备得到的固定化大肠杆菌。本专利技术还提供了一种利用固定化大肠杆菌补料发酵生产L-赖氨酸的方法，包括发酵过程和补料过程，所述补料过程使用的营养成分为葡萄糖和硫酸铵。所述发酵过程包括将含有固定化大肠杆菌的培养基离心除去上清液，补充与培养基等体积的发酵培养基。所述发酵过程使用的培养基配方如下：葡萄糖10～50g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸铜0.01～1g/L、硫酸锌0.01～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水。所述补料过程包括当所述发酵过程中葡萄糖浓度低于15g/L时，流加500g/L～800g/L的葡萄糖水溶液，控制发酵体系的葡萄糖的浓度为2～20g/L，当所述发酵过程中氨氮浓度低于8g/L时，流加300g/L～600g/L硫酸铵水溶液，控制发酵体系的氨氮的浓度为1～10g/L，所述氨氮包括游离氨和铵根离子。所述发酵过程的发酵温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/(min·L)，搅拌速率为100～1000rpm，溶解氧DO≥25％，发酵时间为40～50h，保持pH6.0～7.5使用氨水调控。优选地，所述发酵过程的发酵温度为35℃，pH为6.5。所述的固定化容器和所述发酵过程中使用的发酵罐为搅拌式发酵罐，带有温度、溶氧、pH检测系统，可实现自动控制；同时带有补料系统，满足发酵过程中碳源、氮源的连续补料。L-赖氨酸的单批次发酵生产结束后，将发酵罐内的发酵液全部移除，重新替换新鲜的发酵培养基，利用原始已固定化的大肠杆菌，重复单批次发酵生产L-赖氨酸的条件，如此循环，利用吸附于固定化材料上的大肠杆菌即可实现L-赖氨酸的多批次固定化发酵生产。需要说明的是：游离大肠杆菌和固定化大肠杆菌生长量测定使用紫外分光光度计法，在波长600nm处以水对空白对照检测发酵液吸光值；葡萄糖的测定方法使用SBA-40E型生物传感仪；L-赖氨酸的测定方法使用SBA-40E型生物传感仪；氨氮的测定方法使用凯氏定氮法。有益效果：与现有技术相比，本专利技术优势如下：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌的固定化方法，其特征在于，将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和3‑吗啉丙磺酸的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌的固定化方法，其特征在于，将活化的大肠杆菌接入装有培养基、经过预处理的多孔网状材料和3-吗啉丙磺酸的容器中进行固定化培养，使大肠杆菌在固定化培养过程中吸附于多孔网状材料上。2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述培养基的配方如下：葡萄糖10～50g/L、蛋白胨1～10g/L、硫酸铵0.1～1g/L、磷酸氢二钾0.1～1g/L、磷酸二氢钾0.1～1g/L、酵母提取物1～10g/L、硫酸锰0.1～1g/L、硫酸亚铁0.1～1g/L、硫酸镁0.1～1g/L，溶剂为水，所述培养基体积占所述容器体积的40％～60％。3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述多孔网状材料包括棉纤维、木浆棉、合成海绵、聚酯纤维、细菌纤维素膜、生物过滤棉、丝瓜瓤或木屑，所述预处理包括将多孔网状材料裁剪成1～10cm3的方块，置于体积分数为50％～99％的乙醇水溶液中室温浸泡1～3h，然后用水清洗3～5次。4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述多孔网状材料与所述培养基的比例为3～15g:1L，所述3-吗啉丙磺酸与所述培养基的比例为50～150mM:1L。5.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所述固定化培养的温度为30～42℃，pH为6.0～7.5，通气量为0.03～0.08L/min·L，搅拌速率为100～100...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，张欣，陈勇，余斌，赵南，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32