用于测定活细胞的整合代谢基线及潜力的方法和系统技术方案

目前的技术涉及与快速测定活细胞代谢基线和潜力的方法。实施方案涉及测量细胞内两种主要能量产生通路：线粒体呼吸和糖酵解各自的活性，首先在基线条件下测量，对细胞施加胁迫以需要增加的能量供应后再次测量。在一些实施方案中，可以通过将细胞暴露于两种化合物的组合来应用胁迫：线粒体解偶联剂和ATP合酶抑制剂。在一个实施方案中，通过测量活细胞的耗氧速率来确定线粒体呼吸途径的代谢能量产生活性，并且通过由细胞分泌质子引起的胞外酸化来确定糖酵解途径的代谢能量产生活性。其他实施方案涉及用于确定多孔板的孔中的细胞样品的代谢潜力的装置。

Methods and systems for the determination of the integrated metabolic baseline and potential of living cells

Current techniques involve methods for rapid determination of the baseline and potential of living cell metabolism. The implementation involves measuring two main energy pathways in the cell: the activity of mitochondrial respiration and glycolysis. First, it is measured under baseline condition, exerting stress on cells and measuring again after increasing the energy supply. In some of the implementation schemes, stress can be applied by exposing cells to combinations of two compounds: mitochondrial uncoupling agents and ATP synthase inhibitors. In one embodiment, the metabolic energy of mitochondrial respiratory pathway is determined by measuring the oxygen consumption rate of living cells, and the metabolic energy of glycolysis pathway is determined by extracellular acidification induced by the secretion of protons. Other implementation schemes involve devices used to determine the metabolic potential of cell samples in holes in porous plates.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测定活细胞的整合代谢基线及潜力的方法和系统相关申请本申请要求2015年3月27日递交的美国临时申请62/139,432的利益，兹通过提述将其完整公开并入本文。背景SeahorseBioscience已针对细胞的两条主要产能通路分别开发了两套独立的代谢基线和潜力的测试法。每种测试法均要求添加三种化合物并测量一条代谢通路的活性。有关线粒体功能测试法的示例性的出版物包括S.W.Choi,etal.,J.Neurochem.(2009)109,1179-1191；L.S.Pikeetal.,Biochim.Biophys.Acta(2010),doi:10.1016/j.bbabio.2010.10.022；B.B.Hill,Biochem.J.(2009)424,99-107；D.G.Nichols,etal.,JoVE.(2010)46.www.jove.com/details.php？id-2511，doi:10.3791/2511；B.P.Drankaetal.,FreeRadicalBiology&Medicine51(2011)1621-1635。有关糖酵解功能测试法的示例性出版物包括Pikeetal.,andA.Ibrahim-Hashim,etal,J.CancerSciTher.(November19,2011),Suppl1(4)。D.A.Ferrick,etal.,DrugDiscoveryToday(March2008)13,5/6中公开了对两条通路的联合测量。专利技术概要本专利技术的实施方案包括特定的化合物的组合，利用将组合物的化合物单次暴露于活细胞来同时测量两条代谢通路基线和潜力。令人惊讶地，该测试法测得的结果提供了对两条通路的鲁棒的同时测量。本专利技术的实施方案为用单一注射急剧(acutely)刺激两条代谢/能量通路，并且基于该单一注射确定这些主要通路，即线粒体呼吸作用和糖酵解的代谢潜力提供了可能。线粒体和糖酵解就ATP而言为细胞产生了大部分的能量，而且对于生成生物质以及细胞组分的生物合成反应而言是必不可少的。先前的手段局限于分别单独地刺激并分析两条主要能量通路。先前的手段无法鉴定和产生能够同时刺激两条主要能量通路的化合物。此外，先前的手段无法测量两条主要能量通路对胁迫的同时应答。由于至少4个原因，能够同时刺激两条通路的化合物的鉴定和递送对于本领域技术人员而言是非显而易见的。首先，在SeahorseBioscience商业化其胞外通量(extracellularflux,“XF”)仪器之前，没有技术能够在活细胞中测量两条通路，因此甚至极少有人考虑过该问题。其次，本领域中受过训练的人士绝大部分要么是线粒体的专家，抑或是糖酵解的专家。代谢是由许多“子系统”构成的巨大集合，线粒体和糖酵解只是其中之二。在大多数涉及代谢研究的疾病和学科中，本领域中受过训练的人士仅仅关于对他们的研究最相关的子系统，因而不会知晓如何实施对两条通路都有关的实验，也不会知晓如何解释它。第三，在本专利技术的实施方案中在单一注射中投递的两种化合物，即解偶联剂(uncoupler)和ATP酶抑制剂(寡霉素)，是为研究线粒体而非研究糖酵解而开发的。尽管很多研究者已实证了ATP酶抑制剂在了解线粒体功能中的用处，但SeahorseBioscience是第一家利用ATP酶抑制剂来了解糖酵解功能的公司。例如，Seahorse率先在其糖酵解应激测试中利用寡霉素作为糖酵解系统的胁迫物。最后，本领域技术人员认为糖酵解和氧化磷酸化的作用是相互补偿的。因此，先前的手段一般都基于刺激一条通路、降低另一条通路的前提。本专利技术的实施方案包括了一种根本不同的手段，因为预期两条通路同时被刺激。SeahorseBioscience已经展示了能让人们同时测量耗氧速率(OCR)和胞外酸化速率(ECAR)的技术。见Ferricketal.。但是，还没有人证明，同时注射解偶联剂和ATP酶抑制剂可同时胁迫这两条能量通路，从而可提供代谢潜力(因而表型)的单一指征。可以利用两种分别的手段和两个分别的样品独立地确定各胁迫应激应答，然后数学地合并数据来求得总数。相比之下，根据本专利技术的实施方案的方法利用单一样品和单一注射，由此使用者能够确定细胞的代表线粒体呼吸作用和糖酵解二者的单一代谢基线和潜力。依照本专利技术的实施方案的方法相比于现有技术的确定细胞代谢能力的方法具有若干显著的优势。例如，由于解偶联剂和ATP酶抑制剂是通过单一注射给药的，数据采集可以大大加快，从而容许以高通量规模测量代谢能力。例如，现有技术方法要求在ATP酶抑制剂给药和解偶联剂给药之间有20分钟间隔，在本文描述的方法中消除了该间隔。取而代之的是，根据本专利技术某些实施方案的方法所要求的间隔少于现有技术ATP酶抑制剂给药和解偶联剂给药之间所需的20分钟。例如，某些根据本文中描述的本专利技术的特定实施方案的方法显示，ATP酶抑制剂给药和解偶联剂给药之间的间隔少于20分钟，少于15分钟，少于10分钟，少于5分钟，少于2分钟，或少于1分钟。其他根据本文中描述的本专利技术的特定实施方案的方法显示，ATP酶抑制剂和解偶联剂可以同时施用或者基本上同时(例如，前后紧随)施用。类似地，与在分别的样品中平行测量OCR和ECAR的现有技术方法相比，给定的实验中使用的细胞样品数目可以减少一半。这对于处理稀有的或难培养的细胞(尤其是原代细胞培养物)的研究者来说是一个关键的优势。通过将解偶联剂和ATP抑制剂合并到单一注射中，可以释放分配系统的组件，为进行更复杂的实验提供了可能。最后，由于每个重复的解偶联剂与ATP抑制剂的比例是固定的，与现有技术的方法相比，本文公开的方法所获得的数据消除了一个重要的变异来源。在一个方面，本专利技术的一些实施方案包括一种确定细胞样品的代谢潜力的方法。同时测量细胞样品的初始耗氧速率和初始胞外酸化速率。然后，将线粒体解偶联剂和ATP合酶抑制剂同时施用给细胞样品。然后，同时测量细胞样品的后续耗氧速率和后续胞外酸化速率。确定细胞样品的代谢潜力。可以包括下述的一项或多项特征。至少一种线粒体解偶联剂可以包括羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙(“FCCP”)、羰基氰间氯苯腙(“CCCP”)、或2,4-二硝基苯酚(DNP)或BAM15，或者ATP合酶抑制剂可包括寡霉素或7-氯-5-(4-羟基苯基)-1-甲基-3-(萘-2-基甲基)-4,5,-二氢-1H-苯并[b][1,4]二氮杂卓-2(3H)-酮{7-Chloro-5-(4-hydroxyphenyl)-1-methyl-3-(napthalen-2-ylmethyl)-4,5,-dihydro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-2(3H)-one}(Bz-423)。线粒体解偶联剂可包括羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙(“FCCP”)，且ATP合酶抑制剂可包括寡霉素。细胞样品可包括布置在介质中的多个细胞。测量细胞样品的初始耗氧速率和/或测量细胞样品的初始胞外酸化速率包括感测布置在介质中的细胞组分。介质中施用的线粒体解偶联剂的浓度可以在约0.1μM至约2.0μM的范围，例如约0.5μM。介质中施用的ATP合酶抑制剂的浓度可以在约0.1μM至约2μM的范围，例如约1.0μM。线本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定细胞样品的代谢潜力的方法，所述方法包括以下步骤：测量细胞样品的初始耗氧速率和初始胞外酸化速率；随后，向细胞样品同时施用线粒体解偶联剂和ATP合酶抑制剂；随后，同时测量细胞样品的后续的耗氧速率和后续的胞外酸化速率；和确定细胞样品的代谢潜力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.27 US 62/139,4321.一种确定细胞样品的代谢潜力的方法，所述方法包括以下步骤：测量细胞样品的初始耗氧速率和初始胞外酸化速率；随后，向细胞样品同时施用线粒体解偶联剂和ATP合酶抑制剂；随后，同时测量细胞样品的后续的耗氧速率和后续的胞外酸化速率；和确定细胞样品的代谢潜力。2.权利要求1的方法，其中至少一种所述线粒体解偶联剂包括羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙(“FCCP”)，羰基氰间氯苯腙(“CCCP”)或2,4-二硝基苯酚(“DNP”)或BAM15，且所述ATP合酶抑制剂包括寡霉素或7-氯-5-(4-羟基苯基)-1-甲基-3-(萘-2-基甲基)-4,5,-二氢-1H-苯并[b][1,4]二氮杂卓-2(3H)-酮(Bz-423)。3.权利要求2的方法，其中所述线粒体解偶联剂包括羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙(“FCCP”)，且所述ATP合酶抑制剂包括寡霉素。4.权利要求1的方法，其中所述细胞样品包括布置在介质中的多个细胞。5.权利要求4的方法，其中测量所述初始耗氧速率包括感测布置在所述介质中的细胞组分。6.权利要求4的方法，其中测量细胞样品的初始胞外酸化速率包括感测布置在所述介质中的细胞组分。7.权利要求4的方法，其中施用的线粒体解偶联剂在所述介质中的浓度在约0.1μM至约2.0μM的范围内。8.权利要求7的方法，其中施用的线粒体解偶联剂在所述介质中的浓度为约0.5μM。9.权利要求4的方法，其中施用的ATP合酶抑制剂在所述介质中的浓度为约0.1μM至约2μM。10.权利要求9的方法，其中所述的ATP合酶抑制剂在所述介质中的浓度约为1....

【专利技术属性】
技术研发人员：D·A·费里克，B·德朗卡，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US