本发明专利技术提供了Mfsd2a在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的应用，本发明专利技术另一个方面提供一种生物制品，该制品能够检测Mfsd2a的浓度变化；本发明专利技术的另一个方面提供一种采用荧光标记的方法，以Mfsd2a作为检测标记物，采用UEA I磁珠法从人外周血中分离的循环中的脑血管内皮细胞，在体外用于实验诊断化脓性脑膜炎。本发明专利技术为临床诊断化脓性脑膜炎提供了一种新分子Mfsd2a，并以Mfsd2a为标记物开发了一种基于外周血标本的体外诊断化脓性脑膜炎的方法。
The application of Mfsd2a in the preparation of diagnostic purulent meningitis products
The invention provides a preparation of Mfsd2a in the diagnosis of purulent meningitis in products, another aspect of the invention provides a biological product, the product can detect Mfsd2a concentration; another aspect of the invention provides a method for using fluorescent markers, with Mfsd2a as the detection markers of brain cells vascular endothelial cells isolated from human peripheral blood by UEA I magnetic bead method in circulation, for laboratory diagnosis of purulent meningitis in vitro. The invention provides a new molecule Mfsd2a for clinical diagnosis of purulent meningitis, and develops a method based on Mfsd2a as a marker to diagnose purulent meningitis in vitro.
【技术实现步骤摘要】
Mfsd2a在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的应用
本专利技术属于分子诊断
，尤其涉及Mfsd2a在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的应用。
技术介绍
化脓性脑膜炎是由化脓性细菌引起的以脑膜炎症为主的中枢神经系统感染性疾病，以婴幼儿发病居多，病原菌常见为大肠埃希氏菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌及脑膜炎双球菌等。化脓性脑膜炎造成血-脑屏障功能破坏和中性粒细胞浸润等病理变化。新生儿脑炎是新生儿三大最常见的疾病之一，在全世界范围内每年导致约393000名新生儿死亡。化脓性脑膜炎的诊断主要依赖于脑脊液中细胞计数等检查，但在临床工作中确诊化脓性脑膜炎有时是相当困难的，因为早期临床症状有时是轻微的（特别对于无法自述症状的婴幼儿），通过腰椎穿刺等有创性的检查而获得脑脊液在临床中受到限制，尤其是新生儿早产，脂肪或低出生体重。所以临床上迫切需要探索和开发一种从外周血中分离血脑屏障细胞作为新的生物标志物的无创性的诊断方法，从而有效的诊断中枢神经系统感染，降低死亡率和伤残率。
技术实现思路
本专利技术提供了Mfsd2a在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。本专利技术的一个方面提供Mfsd2a的一种新用途，即在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的应用；本专利技术另一个方面提供一种生物制品，该制品能够检测Mfsd2a的浓度变化；本专利技术的另一个方面提供一种采用荧光标记的方法，以Mfsd2a作为检测标记物，采用UEAI磁珠法从人外周血中分离的循环中的脑血管内皮细胞，在体外用于实验诊断化脓性脑膜炎。本专利技术为临床诊断化脓性脑膜炎提供了一种新分子Mfsd2a，并以Mfsd2a为标记物开发了一种基于外周血标本的体外诊断化脓性脑膜炎的方法。附图说明图1大肠埃希氏菌刺激HBMECs后Mfsd2a的表达量的变化（A-B）.图2Westernblot分析感染大肠埃希氏菌的C57BL/6J小鼠血液和脑脊液中Mfsd2a的变化(A-C)。图3大肠埃希氏菌刺激后，采用UEA磁珠法从小鼠外周血中分离的cBMECs(A-B)的变化。图4Westernblot分析感染大肠埃希氏菌的新生儿脑炎患儿脑脊液中Mfsd2a的变化(A-B)。图5分离外周血中cBMECs方法的技术路线图。具体实施方式本专利技术所使用的Mfsd2a，为主要促进调解超家族蛋白2A（Majorfacilitatorsuperfamilydomain-containingprotein2a，Mfsd2a）。实施例1：在体外所述用造成儿童细菌性脑膜炎主要病原的大肠埃希氏菌，在体外刺激人脑血管内皮细胞Humanbrainmicrovascularendothelialcells(HBMECs),证实在体外大肠埃希氏菌刺激HBMECs(0.5916±0.041与对照组(0.278±0.043)相比Mfsd2a表达量显著性升高（P=0.0060)（图1）。体内实验，在新生C57BL/6J小鼠脑膜炎动物模型体内注射大肠埃希氏菌，检测小鼠体内血液及脑脊液中Mfsd2a含量的变化，证实大肠埃希氏菌刺激的新生C57BL/6J小鼠(1.824±0.323Int/mm2)外周血中的Mfsd2a含量与对照组(0.314±0.141Int/mm2)相比Mfsd2a表达量显著性升高(P=0.0055)。同时大肠埃希氏菌刺激的新生C57BL/6J小鼠(2567.0±434.8Int/mm2)脑脊液中中的Mfsd2a含量与对照组(702.2±297.1Int/mm2)相比Mfsd2a表达量显著性升高(P=0.0122)（图2）。在新生C57BL/6J小鼠脑膜炎动物模型体内注射大肠埃希氏菌，检测小鼠体内血液中Mfsd2a含量显著升高。采用荧光标记的方法，以Mfsd2a作为检测的分子标记物，在大肠埃希氏菌刺激后，采用UEAI磁珠法从小鼠外周血中分离的循环中的脑血管内皮细胞(CircleHumanbrainmicrovascularendothelialcells,cBMECs)(A-B),证实大肠埃希氏菌刺激的新生C57BL/6J小鼠(2567.0±434.8Int/mm2)外周血中的中的以Mfsd2a为标记的cBMECs含量（106.3±6.3/ml）与对照组(10.0±1.29/ml)相比，以Mfsd2a为标记的cBMECs的细胞数显著性升高(P<0.001)（图3）。实施例2：进一步优选的，在新生儿感染大肠埃希氏菌的人脑脊液中，检测人脑脊液中Mfsd2a含量的变化，证实感染大肠埃希氏菌的人脑脊液中Mfsd2a含量（12650±2734Int/mm2）与对照组(3953±424Int/mm2）相比Mfsd2a表达量显著性升高(P=0.0348))(图4)。采用Westernblot方法来检测HBMECs、老鼠大脑和CSF以及临床脑脊液样本中的Mfsd2a蛋白质的表达水平。将脑组织悬浮在含有1%蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)裂解物的缓冲液中(CellSignalingTechnology公司),然后在4°C环境下，在12000g离心15分钟。所有的蛋白质产物均储存在-80°C。将30µL鼠CSF用400µLPBS稀释后用于蛋白质电泳。临床脑脊液样本同样需要在4°C环境下，在12000g离心15分钟，并-80°C存储备用。用10%Tris-glycine凝胶采用SDS–PAGE方法对脑脊液蛋白质进行分离，待样品跑出点样孔之后，电压调为180V，约跑2小时后收胶。刀片切下目标条带附近的胶块后转至半干转膜仪上，胶块置于转印膜（PVDF膜）上；二者置于6层滤纸中间。滤纸先经甲醇浸泡再泡入Transferbuffer中。转移完毕后盖上转膜仪通电，电流为8毫安左右并转移到硝化纤维膜。转膜结束后，取下PVDF膜并做好标记浸泡入5%的脱脂奶粉（用pH7.2的PBS配制）中4℃封闭90min。取出转印膜后放入兔抗Mfsd2a(1:500)和兔抗β-actin(1:10000)一抗中，放在4℃的摇床上轻摇过夜孵育。吸出一抗后，加入5倍体积的PBST洗去非特异性结合，摇床速度加倍；每15min一次，共4次。洗膜被孵化的辣根过氧化物酶标记的二抗(兔抗鼠的IgG)1h，4℃的摇床上轻摇45min；吸去二抗，加入5倍体积的PBST洗去非特异性结合，摇床速度加倍；每15min一次，共4次。取出结合完毕的转印膜放入PBS中，然后根据Roche公司的Lumi-lightWesternBlottingSubstrate产品说明进行显色；即可去调整曝光时间暗室中显影。采用QuantityOne仪器(Version4.6.2,Bio-RadLaboratories,Hercules,USA)对Mfsd2a进行相对量分析。本专利技术的另一个方面提供一种采用荧光标记的方法，以Mfsd2a作为检测标记物，采用UEAI磁珠法从人外周血中分离的循环中的脑血管内皮细胞(Circlebrainmicrovascularendothelialcells,cBMECs)，在体外用于实验诊断化脓性脑膜炎（图5）。分离和计数cBMECs外周血中cBMECs与UlexeuropaeusI(UEAI)凝集素(L-1060)包被的Dynabeads磁珠结合，磁珠按照制造商的的说明本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Mfsd2a的一种新用途，是在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的用途。
【技术特征摘要】
1.一种Mfsd2a的一种新用途，是在制备诊断化脓性脑膜炎制品中的用途。2.一种用于备诊断化脓性脑膜炎制品中的生物制品，其特征在于，所述的生物制品能够检测Mfsd2a的浓度。3.如权利要求2所述的生物制品，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王世富，张乐海，王素兰，李政，于风岭，
申请(专利权)人：济南市儿童医院，
类型：发明
国别省市：山东,37
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