一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒，该试剂盒由非对称PCR单链DNA模板富集PCR扩增引物、靶序列互补淬灭探针、LA DNA聚合酶等组成。通过非对称特异性PCR单链DNA模板富集人类β珠蛋白基因突变位点目的序列、特异性荧光探针的分子杂交及解链分析，检测受检样本的β‑地贫点突变基因型。该试剂盒对检测β‑地中海贫血突变位点的野生型和突变型具有良好的敏感性和准确性，重复性和稳定性很好，完全适用于β‑地中海贫血点突变的临床检测。

Target sequence complementary quenching probe and kit for detecting point mutation of beta globin gene

The invention discloses a method for detecting beta globin gene mutation of complementary target sequence quenched probe and kit. The kit comprises a non symmetrical PCR single strand DNA template enriched PCR primers, complementary target sequence quenching probe, LA DNA polymerase etc.. The asymmetric hybridization specificity of PCR single strand DNA template enriched human beta globin gene mutation objective, sequence specific fluorescent probe and solution chain analysis, beta thalassemia detection sample being mutation. The kit for the detection of beta thalassemia mutations wild type and mutant has a good sensitivity and accuracy, good repeatability and stability, completely suitable for clinical detection of point mutations in the beta Mediterranean anemia.

【技术实现步骤摘要】
一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒
本专利技术属于分子检测领域，具体涉及一种检测β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针及其试剂盒。
技术介绍
人类β-珠蛋白基因簇位于11号染色体上，表达β珠蛋白链，与α珠蛋白链结合，形成具有功能血红蛋白四聚体。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当(1:1)，当β珠蛋白基因缺陷，导致β链合成减少而α链相对过剩，即可导致β-地中海贫血疾病。地中海贫血(简称“地贫”)是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一，主要集中在地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方，保守估计全世界携带者近2亿人。临床上分为α-地贫和β-地贫。此病无有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群分子筛查，对夫妇双方均为同类型地贫携带者的孕期胎儿进行产前诊断，以阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。导致β珠蛋白链合成减少而引起β-地中海贫血的根本原因是β珠蛋白基因突变，又称β-地贫基因突变，包含点突变和大片段缺失两种类型。β-地贫主要由β珠蛋白基因点突变所引起(98％以上)。到目前为止，全世界已发现了200多种β-地贫基因突变，在中国已报道有60多种，其中中国南方报道有50余种。β-地贫基因不但遗传异质性大，还存在明显的地域性。在中国人群中，CD41-42(-CTTT)、CD17(A>T)、–28(A>G)、CD26(G>A)、IVS-Ⅱ-654(C>T)和CD71-72(+A)这6种突变占了全部突变类型的90％以上；另外–32(C>A)、–31(A>C)、–30(T>C)、-29(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD14/15(+G)、CD71/72(+T)、CD43(G>T)、CD27/28(+C)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)在中国人群中也有一定的基因频率。众所周知，通过DNA分析而获得β-地贫基因型，不但是对个体β-地贫进行准确诊断的依据，也是提供遗传咨询、实施防控措施的基础。当前β-地贫基因点突变的分子诊断和产前诊断策略，是采用相应的技术方法，分析β珠蛋白基因是否存在点突变。检测技术的发展历程中，扩增阻碍突变系统PCR(ARMS-PCR)，是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。随后采用的等位基因特异性寡核苷酸杂交法(ASO)，大大减少了假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。当前在临床上常规使用的反向点杂交法(RDB)，可同时检测中国人群中常见和次常见的17种突变类型，在一定程度上减小了劳动强度，增加了检测通量，可是，此技术的操作流程依然繁琐，先PCR扩增β珠蛋白基因2－3个目的DNA片段，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。DNA测序分析也是当前可选的一种β珠蛋白基因点突变检测方案，此技术操作过程是先PCR扩增，再PCR产物纯化、测序PCR反应、测序仪上毛细管电泳分析等，同样存在操作繁琐、携带污染等问题。这些方法，检测成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小，难以实现自动化和标准化，且存在PCR产物携带污染等技术局限，不能满足当前α-地贫的大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。继RDB技术之后的改良分子信标解链技术[β-地中海贫血基因检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)，国食药监械(准)字2013第3401294号]，实现了技术方案和检测方法的根本性改变，自动化、高通量、一次性闭管，操作简单大大降低了工作量，也大大降低了试剂成本。但经过2－3年的临床应用，也凸现了此试剂盒技术方案和检测体系的局限性，有些中国南方较为多见的突变位点不在检测范围，如InitiationCD(ATG>AGG)、CAP+1(A>C)等，还有诸如-28(A>C)与-29(A>G)、CD41/42(-CTTT)与CD43(G>T)等相邻的突变位点不能准确区分。随着目前以降低地贫患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及地贫分子机制及分子流行病学的深入研究，准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法，是这些项目实施的技术支撑条件，更是当前地中海贫血分子诊断的迫切需要。针对上述β珠蛋白基因点突变检测分析的技术局限，研发相应的技术方法，一次性闭管操作以防止PCR产物携带污染，单反应管检测多种突变类型以提高检测通量且简化操作强度，仪器自动检测分析以实现自动和标准化，是目前方法学研究的主要方向。
技术实现思路
为了解决现有技术中所存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种可以一次性闭管检测中国人群中常见β珠蛋白基因点突变类型的检测试剂盒，所述的基因点突变类型包括–32(C>A)、–31(A>C)、–30(T>C)、-29(A>G)、-28(A>G)、Cap+1(A>C)、Int(ATG>AGG)、CD17(A>T)、CD14/15(+G)、CD41/42(-TCTT)、CD71/72(+A)、CD71/72(+T)、IVS-2-654(C>T)、CD26(G>A)、CD43(G>T)、CD27/28(+C)、IVS-1-1(G>T)、IVS-1-5(G>C)、CD31(–C)、CD37(G>A)。本专利技术的目的在于提供用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组。本专利技术的另一目的在于提供一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒。本专利技术的再一目的在于提供一种检测β珠蛋白基因点突变的方法。本专利技术所采取的技术方案是：用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组，所述靶序列互补淬灭探针组的序列如SEQIDNO：5～36所示。一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒，该试剂盒含有SEQIDNO：5～36所示的靶序列互补淬灭探针组。进一步的，该试剂盒还含有特异性扩增β珠蛋白基因突变热点序列的引物组。进一步的，所述引物组序列如SEQIDNO：1～4所示。进一步的，该试剂盒还含有TaKaRaLATaq酶、LATaqBuffer、dNTPS、甜菜碱。一种检测β珠蛋白基因点突变的方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的gDNA及以配制检测试剂，检测试剂的配制体系如下：其中，1F：5’-gccaaggacaggtacggctgtcatc-3’(SEQIDNO：1)；1R：5’-ggcaaaggtgcccttgaggttgtc-3’(SEQIDNO：2)；2F：5’-cagggcaataatgatacaatgtatcatgc-3’(SEQIDNO：3)；2R：5’-gctgtgggaggaagataagaggtatgaac-3’(SEQIDNO：4)28-32W：5’-ROX-agggctgggcataaaagtcagcca-BHQ2-3’(SEQIDNO：5)；-32M：5本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组，其特征在于，所述靶序列互补淬灭探针组的序列如SEQ ID NO：5～36所示。

【技术特征摘要】
1.用于检测人类β珠蛋白基因点突变的靶序列互补淬灭探针组，其特征在于，所述靶序列互补淬灭探针组的序列如SEQIDNO：5～36所示。2.一种检测β珠蛋白基因点突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求1所述的靶序列互补淬灭探针组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有特异性扩增β珠蛋白基因突变热点序列的引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组序列如SEQIDNO：1～4所示。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还含有TaKaRaLATaq酶、LATaqBuffer、dNTPS、甜菜碱。6.一种检测β珠蛋白基因点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取样品中的gDNA及以配制检测试剂，检测试剂的配制体系如下：其中，1F：5’-gccaaggacaggtacggctgtcatc-3’(SEQIDNO：1)；1R：5’-ggcaaaggtgcccttgaggttgtc-3’(SEQIDNO：2)；2F：5’-cagggcaataatgatacaatgtatcatgc-3’(SEQIDNO：3)；2R：5’-gctgtgggaggaagataagaggtatgaac-3’(SEQIDNO：4)28-32W：5’-ROX-agggctgggcataaaagtcagcca-BHQ2-3’(SEQIDNO：5)；-32M：5’-ROX-ctagctgggaataaaagtcaggctag-BHQ2-3’(SEQIDNO：6)；-31M：5’-ROX-ctgagctgggcctaaaagtctcag-BHQ2-3’(SEQIDNO：7)；-30M：5’-ROX-agctgggcacaaaagtcagca-BHQ2-3’(SEQIDNO：8)；-29M：5’-ROX-cagtgctgggcatgaaagtcactg-BHQ2-3’(SEQIDNO：9)；-28M：5’-ROX-cagtgctgggcatacaagtcactg-BHQ2-3’(SEQIDNO：10)；Cap+1W：5’-FAM-agaagctattgcttacatttgcttc-BHQ1-3’(SEQIDNO：11)；Cap+1M：5’-FAM-tctgcttccatttgcttctgcaga-BHQ1-3’(SEQIDNO：12)；IntW：5’-CY5-cgaagatcaaacagacaccatggtgcatcttcg-BHQ2-3’(SEQIDNO：13)；Int-M：5’-CY5-gatgcagacaccagggtgcatc-BHQ2-3’(SEQIDNO：14)；CD14-17W：5’-HEX-tcggaagtggggcaaggtgaacgttccgt-BHQ1-3’(SEQIDNO：15)；CD14/15M:5’-HEX-cctgacttactgccctggtgggtttagtcagg-BHQ1-3’(SEQIDNO：16)；CD17M:5’-HEX-tctgtatgtggggctaggtgaatacagt-BHQ1-3’(SEQIDNO：17)；CD26-28W:5’-FAM-ccatgaaaggtggtgaggccctggaatcatgg-BHQ1-3’(SEQIDNO：18)；CD26M:5’-FAM-tctgactagttggtggtaaggcct...

【专利技术属性】
技术研发人员：周万军，徐湘民，熊符，张强，温晓君，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44