人类卵母细胞胞浆成熟优化液制造技术

本发明专利技术公开了一种人类卵母细胞胞浆成熟优化液。本发明专利技术以低糖的TCM199组织培养液联合患者自体血清为基础，通过添加一些重要的激素、能量物质及高效抗氧化剂褪黑素(melatonin)开发了本发明专利技术。本发明专利技术开发了一种适合用于IVF‑ET周期中卵母细胞胞浆的成熟优化，也适合用于周期中未成熟卵母细胞的体外成熟后再利用的培养液。本发明专利技术不仅能改善成熟卵母细胞的胞浆成熟度，临床结果证明卵母细胞的优质胚胎率大大提高，也能提高未成熟卵母细胞的发育潜能，证明了IVF‑ET周期中部分未成熟卵母细胞具有再利用价值。

Human oocyte cytoplasmic maturation optimization

The present invention discloses a human oocyte cytoplasmic maturation optimization solution. The invention is based on the low sugar TCM199 tissue culture fluid combined with the autologous serum of the patient, and the invention is developed by adding some important hormones, energy substances and highly effective antioxidant melatonin (melatonin). The invention provides a suitable for the optimization of mature oocytes IVF ET cycle slurry, also suitable for medium recycling of immature oocytes in vitro maturation cycle. The invention can not only improve the cytoplasmic maturation of oocytes maturation, clinical results show that high quality embryo rate of oocytes increased greatly, but also can improve the developmental potential of the immature oocytes, proved that IVF ET cycle in immature oocytes with recycling value.

【技术实现步骤摘要】
人类卵母细胞胞浆成熟优化液
本专利技术涉及人类卵母细胞胞浆成熟优化液，属于生殖医学工程领域。
技术介绍
体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryotransfer,IVF-ET)患者经过控制性超促排卵后卵巢上能发育生长多个卵泡，取卵后这些卵子被移入培养液中培养4-6h，随后这些卵子与精子相互作用进行体外受精。为什么取卵后卵子要体外培养一段时间？因为，正常情况下，取卵后这些卵子中的大多数卵子的胞核是成熟的，以排出的第一极体为标志，但胞浆存在不够成熟状态，这时必须在特定培养液中培养一段时间以促进卵子胞浆成熟，卵胞浆不成熟大大降低卵子的受精率，胚胎形成率以及优质胚胎率，最终影响IVF-ET的成功率。因此，取卵后卵母细胞在特定的胞浆成熟液中培养是至关重要的。另外，控制性超促排卵所获卵母细胞约15％为未成熟卵母细胞，其中4％为GV(Germinalvesicle)期卵，11％约为MI(MetaphaseI)期卵。这些未成熟卵母细胞，即体内成熟失败卵母细胞，在发育过程中自始至终一直经受来自优势卵泡的压制，因此，这让我们产生了一些疑问：此类受过优势卵泡压制的未成熟卵母细胞经过体外成熟培养能否发育至成熟阶段？若能发育成熟，它们受精后又能否发育为一名健康的婴儿？1998年，Tucker等将一患者的29枚新鲜卵子冷冻(16枚成熟卵和13枚GV卵)，解冻后仅存活2枚GV卵，体外培养30h后行ICSI(卵胞浆内单精子显微注射技术)，获两枚正常胚胎，移植后孕育一健康女婴。1999年，A.DeVos等将896枚控制性促排卵周期所获的MI卵体外培养4h后获1210枚成熟卵，ICSI后行可用胚胎移植15个周期，获一例健康婴儿分娩。以上报道表明：控制性超排卵周期中部分未成熟卵母细胞通过IVM技术可以获得健康后代。但，后续的大量研究结果显示，此类卵子经成熟培养，体外受精和胚胎体外培养很少能发育至囊胚阶段。这一结果表明：控制性超排卵周期中的未成熟卵母细胞的利用率非常低下。如果这些未成熟卵母细胞能利用一种特定的培养液，经体外成熟，受精，胚胎培养及胚胎移植后能获得健康代，意义是非常重大的。一方面人未成熟卵母细胞体外成熟后可以捐赠给卵子库，或用于研究；另一方面也可以归患者自身应用，提高累积妊娠率。迄今未止，生殖界仍没有一款专业、高效的人类卵母细胞胞浆成熟优化液。正常情况，取卵后，卵子被移入卵子受精液中培养4-6h，随后行体外受精，胚胎培养和移植。而收集到的未成熟卵子，常规被认为无任何利用价值而被直接丢弃。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种专业、高效的人类卵母细胞胞浆成熟优化液，用于IVF-ET周期中卵母细胞胞浆的成熟优化，另外也用于周期中未成熟卵母细胞的体外成熟后再利用。本专利技术的人类卵母细胞胞浆成熟优化液，包含有(78％-83％)体积的基础培养液TCM199和(17％-22％)体积的人自体血清，TCM199与人自体血清的总体积为100％；其中还含有丙酮酸钠，FSH，HCG，雌激素，抑菌剂，melatonin。优选的，所述抑菌剂为双抗。上述所述的人类卵母细胞胞浆成熟优化液，优选的，以TCM199与人自体血清的总体积为基准，其中还含有(0.0020-0.0025)g/ml丙酮酸钠，(0.070-0.080)IU/ml的FSH，(0.4-0.6)IU/mlHCG，(0.6-1.0)μg/ml雌激素，(0.0050-0.0070)g/100ml双抗，(8-12)μMmelatonin。上述所述的人类卵母细胞胞浆成熟优化液，优选的，其组分组成为：80％TCM199+0.0022g/ml丙酮酸钠+0.075IU/mlFSH+0.5IU/mlHCG+0.8μg/ml雌激素+20％人自体血清+0.0060g/100ml双抗+10μMmelatonin。本专利技术中所述双抗可以为常用的青霉素和链霉素，其用量比可以为1:1，双抗的用量表达是为青霉素和链霉素的各自用量，如(0.0050-0.0070)g/100ml双抗是指含(0.0050-0.0070)g/100ml青霉素、(0.0050-0.0070)g/100ml链霉素；0.0060g/100ml双抗是指含0.0060g/100ml青霉素、0.0060g/100ml链霉素。本专利技术以低糖的TCM199组织培养液联合患者自体血清为基础，通过添加一些重要的激素、能量物质及高效抗氧化剂褪黑素(melatonin)开发了本专利技术。本专利技术中，丙酮酸钠为能量物质，为卵子成熟提供能量；FSH，HCG和雌激素促进卵子核及胞浆成熟；双抗，抑制培养液中细菌生长；melatonin,抗氧化剂，清除培养过程中培养液中产生的氧活性物质(ROS)，另外也促进卵子胞浆成熟。本专利技术开发了一种适合用于IVF-ET周期中卵母细胞胞浆的成熟优化，也适合用于周期中未成熟卵母细胞的体外成熟后再利用的培养液。不仅能改善成熟卵母细胞的胞浆成熟度，临床结果证明卵母细胞的优质胚胎率大大提高，也能提高未成熟卵母细胞的发育潜能，证明了IVF-ET周期中部分未成熟卵母细胞具有再利用价值。经安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心对本专利技术的应用发现，IVF/ICSI临床妊娠率上升达15％，ICSI周期中未成熟卵母细胞再利用方面，已出生3例健康的试管婴儿。本专利技术应用了患者自体血清，添加了褪黑素(melatonin)，褪黑素不仅能清除体外培养过程中产生的ROS，而且可以高效地促进卵母细胞核及胞浆成熟。本专利技术应用于试验中对未成熟卵母细胞进行体外培养，那些未成熟卵母细胞均为去除了颗粒细胞后的裸卵，这也打破了人类未成熟卵子体外成熟培养必须含颗粒细胞的理论。本专利技术带来了多项理论突破：①人类未成熟卵母细胞体外成熟培养可以去除颗粒细胞，②超排卵周期中一些未成熟卵母细胞可以被再次利用，③可以应用于IVF或ICSI周期优化MII卵子的胞浆成熟度，以达到提高优质胚胎率的目的。具体实施方式下述实施例是对于本
技术实现思路
的进一步说明以作为对本专利技术
技术实现思路
的阐释，但本专利技术的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本专利技术实质精神的简单变化或替换均应属于本专利技术所要求的保护范围。实施例1本专利技术的人类卵母细胞胞浆成熟优化液的组成如下：80％TCM199(V/V)+0.0022g/ml丙酮酸钠+0.075IU/mlFSH+0.5IU/mlHCG+0.8μg/ml雌激素+20％(V/V)人自体血清+0.0060g/100ml双抗+10μMmelatonin。其中：1.基础培养液：TCM199‐‐‐100ml装，批号为M4530，低糖，不含HEPEAS，公司Sigma；2.双抗：选用PENICILING(青霉素)和STREPTOMYCINSULFATE(链霉素)，批号分别为：LOT17H1214；LOT58H0442，公司SIGMA；3.丙酮酸钠：选用PYRUVICACIDSODIUM(a‐ketopropionicacid)，P‐2256，25mg，批号：LOT19H0645，公司SIGMA；4.雌激素：β‐ESTRADIOL(17β‐Estradiol)(雌激素),E‐2758,250mg,批号：052K13705，公司SIGMA；5.FS本文档来自技高网...

【技术保护点】
人类卵母细胞胞浆成熟优化液，包含有(78％‑83％)体积的基础培养液TCM199和(17％‑22％)体积的人自体血清，TCM199与人自体血清的总体积为100％；其中还含有丙酮酸钠，FSH，HCG，雌激素，抑菌剂，melatonin。

【技术特征摘要】
1.人类卵母细胞胞浆成熟优化液，包含有(78％-83％)体积的基础培养液TCM199和(17％-22％)体积的人自体血清，TCM199与人自体血清的总体积为100％；其中还含有丙酮酸钠，FSH，HCG，雌激素，抑菌剂，melatonin。2.如权利要求1所述的人类卵母细胞胞浆成熟优化液，其特征在于，所述抑菌剂为双抗。3.如权利要求1或2所述的人类卵母细胞胞浆成熟优化液，其特征在于，其中含有(0.0020-0.0025)g/ml丙酮酸钠，(0.070-0.08...

【专利技术属性】
技术研发人员：章志国，曹云霞，魏兆莲，周平，陈蓓丽，邹薇薇，郝燕，纪冬梅，高明，谢芬芬，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34