棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用制造技术

本发明专利技术提供了棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。所述棘孢木霉菌TD3104的保藏编号是CGMCC 13161。本发明专利技术提供了所述棘孢木霉菌在防治烟草、苹果植物病原菌中的应用。本发明专利技术提供的拮抗菌能有效抑制烟草黑胫病菌、烟草青枯病菌、立枯丝核菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病和苹果腐烂病、苹果轮纹病的病原菌生长，可以有效防治相关病害，并且可以减少化学农药的用量及其土壤中的累积，有利于我国经济作物的质量和产量的提高，经济效益和社会效益十分显著。

Trichoderma TD3104 and its application in the preparation of microbial agents against plant pathogens

The present invention provides Trichoderma TD3104 and its application in the preparation of microbial agents for inhibiting plant pathogens. The accession number of the asperellum Trichoderma TD3104 is CGMCC 13161. The present invention provides the application of the Trichoderma in the prevention and control of tobacco and apple plant pathogenic bacteria. The present invention provides antagonistic bacteria can effectively inhibit Phytophthora nicotianae, Ralstonia solanacearum, Rhizoctonia solani, Fusarium root rot, pathogen of tobacco Alternaria alternata and apple rot, apple canker pathogen growth, can effective prevention and treatment of related diseases, and can reduce the amount of accumulation and soil chemistry the pesticide, is conducive to the economic crops in China to improve quality and yield, economic benefits and social benefits are very significant.

【技术实现步骤摘要】
棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用
本专利技术属于微生物和生物防治领域，尤其涉及棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。
技术介绍
烟草、苹果均是我国重要的经济作物，其产量及质量关系着种植户的切身利益。高品质烟草对产区的土壤及环境条件有一定的要求，因此烟草连作的现象普遍发生。连作后病害加重、产量下降。近年来苹果枝干病害发生严重，苹果腐烂病和苹果轮纹病联合侵染，逐年加重。目前，控制烟草、苹果病害的一般方法是使用化学农药；然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时会造成农药残留超标和环境污染。因此，生产中急需一种有效、安全、环保的控制烟草病害新技术；生物防治是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制引起作物病害的病原菌的生长，是控制植物病害的一种新途径。
技术实现思路
针对现有技术中化学农药防治造成环境污染、烟草连作病害发生严重和苹果枝干病害逐年严重等问题，本专利技术的目的是提供了一株棘孢木霉TD3104及其在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。本专利技术所述棘孢木霉菌TD3104自土壤中分离获得。使用本专利技术所述生防菌防治烟草、苹果病害，可以减少化学农药的用量及其在土壤中的累积，防止环境污染，有利于提高作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用下述技术方案予以实现：本专利技术提供了一株棘孢木霉菌TD3104，其分类命名为棘孢木霉菌Trichodemaasperellum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCC13161。进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104的菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，分生孢子梗对生，主分支呈树状；瓶梗短，呈旋涡状排列、安瓿形，基本变细，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵形。进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104的ITS序列如SEQIDNo:1所示。本专利技术还提供了所述的棘孢木霉菌TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。进一步的：所述植物为烟草和苹果。进一步的：所述病原菌包括：烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草青枯病菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病菌、苹果腐烂病菌和苹果轮纹病菌。进一步的：所述棘孢木霉菌对病原菌的拮抗机制是重寄生作用、竞争作用和抗生作用。进一步的：所述菌剂中棘孢木霉菌TD3104有效活菌为1×108～1×109cfu/克。进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104对烟草病原菌的抑制率在52.1％-100％。进一步的：所述棘孢木霉菌TD3104对苹果病原菌的抑制率在60.7％-100％。与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是：本专利技术提供的拮抗菌棘孢木霉菌TD3104是专利技术人自土壤分离的优良生防菌株，对烟草多种病原及苹果主要枝干病害均有较好的抑制作用，抗病性广谱，抗病性表现为营养竞争、寄生、代谢产物拮抗等多种方式。能有效抑制烟草黑胫病菌、立枯丝核菌、烟草青枯病菌、烟草根腐病病原菌镰刀菌、烟草赤星病、苹果腐烂病和苹果轮纹病等病原菌的生长，使用以拮抗菌为有效成分的复合菌剂可以有效防治烟草病害，并且可以减少化学农药的用量和其在土壤、果树中的累积，对于防止环境及果品污染极为重要，同时，也有利于提高我国烟草、苹果等作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。附图说明图1表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对烟草黑胫病的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养15天)。图2表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对立枯丝核菌的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养15天)。图3表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对烟草根腐镰刀菌的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养15天)。图4表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对烟草赤星病菌的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养15天)。图5表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对苹果腐烂病的抑制作用(左图为培养3天，右图为培养10天)。图6表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对苹果轮纹病的抑制作用(左图为培养5天，右图为培养10天)。图7表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对烟草青枯病的抑制作用(培养2天)。图8表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对苹果枝干病害病原菌菌丝的作用(A:正常苹果腐烂病病原菌菌丝，B：拮抗菌处理的苹果腐烂病病原菌菌丝，C：正常苹果轮纹病病病原菌菌丝，D：拮抗菌处理的苹果轮纹病病原菌菌丝)。图9表明本专利技术中棘孢木霉菌TD3104对烟草黑胫病的抑制作用(A:对照烟苗基部病症；B：对照烟苗病茎纵刨面)。图10表明不同含量棘孢木霉菌TD3104发酵液对苹果腐烂病菌的抑菌率。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。实施例1：拮抗菌的分离采用土壤稀释分离法对玉米根围土壤进行分离，本专利技术所述棘孢木霉菌TD3104即是从此土壤中分离得到，通过将分离物单孢纯化，分别与常见烟草病原菌在PDA平板上两点对峙接种，进行平板拮抗试验，最终筛选得到。实施例2、拮抗菌的鉴定1、拮抗菌的形态学鉴定实验所用培养基如下：(1)马铃薯—葡萄糖琼脂(PDA)：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL，煮沸10min，纱布过滤，滤液加20g琼脂、20g葡萄糖，再加热使其熔化，最后定容到1000mL，121℃灭菌20min。(2)LB培养基：胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，蒸馏水1000mL，pH7.4，121℃灭菌20min。(3)LB固体培养基：在LB培养基中加入20g/L的琼脂。(4)燕麦培养基：燕麦片30克，琼胶20克，水1000mL，121℃灭菌20min。(5)马铃薯—葡萄糖(PD)：PDA去掉琼脂。将筛选到的菌株接种到PDA平板上，置于28℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况。菌落形态为：菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，生长快速，培养48h后菌落直径达70mm左右，并产生大量白色孢子；分生孢子簇呈半球状，排列为同心轮纹，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端具有2个或多个瓶梗，主轴顶端下面生出的初次分枝呈对生，与主轴的夹角近90度，主分支呈树状；瓶梗直，呈旋涡状排列、安瓿形，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵球形。本专利技术经试验证明棘孢木霉菌TD3104能够产生几丁质酶、纤维素酶和木聚糖酶。2、拮抗菌的ITS序列鉴定本实例根据拮抗菌的ITS序列来对其进行分子鉴定。采用CTAB法提取菌株的基因组DNA。以菌株的基因组DNA为模板，ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物扩增菌株的ITS序列。扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化后，连接转化，选取阳性克隆送往北京诺赛基因公司进行测序。通过与GenBank中已有的ITS序列进行Blast相似性比较确定菌株的种类。结合菌株的形态学特征和ITS比对结果，最终将菌株确定为棘孢木霉菌Trichodemaasperellum。ITS序列如下(SEQIDNo:1)：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株棘孢木霉菌TD3104，其特征在于：其分类命名为棘孢木霉菌

【技术特征摘要】
1.一株棘孢木霉菌TD3104，其特征在于：其分类命名为棘孢木霉菌Trichodemaasperellum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是：CGMCCNo.13161。2.根据权利要求1所述的棘孢木霉菌TD3104，其特征在于：所述棘孢木霉菌TD3104的菌落白色，质地絮状，有同心轮纹结构，分生孢子梗对生，主分支呈树状；瓶梗短，呈旋涡状排列、安瓿形，基本变细，中间膨大，底部瓶梗较顶部长，分生孢子白色，球形或卵形。3.根据权利要求1所述的棘孢木霉菌TD3104，其特征在于：所述棘孢木霉菌TD3104的ITS序列如SEQIDNo:1所示。4.权利要求1所述的棘孢木霉菌TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用。5.根据权利要求4所述的棘孢木霉菌TD3104在制备抑制植物病原菌的菌剂中的应用，其特征在于：所述植物为烟草和苹果。6.根据权利要求5所述的棘孢木霉菌TD3104在制备抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雅华，刘新，咸洪泉，赵方贵，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37