无患子果皮活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用技术

本发明专利技术属于天然产物有效成分的提取工艺技术领域，具体涉及一种无患子果皮活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用。将无患子果皮粉碎，用溶剂处理，合并处理得到的提取液，浓缩，将浓缩液通过D392型弱碱性阴离子交换树脂柱，依次用水和不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液，将收集的洗脱液进行浓缩、干燥，即得产品。采用本发明专利技术所述方法提取纯化所得的无患子果皮活性提取物纯度达到95％以上，具有成本低、操作简便、纯度高、活性好、机制明确、无毒副作用的特点。由本发明专利技术所述的制备方法制备的无患子果皮活性提取物，应用于抗真菌药物中，尤其适用于制备白色念珠菌、红色毛癣菌、被膜念珠菌感染等所致疾病的药物。

Preparation method and antifungal application of active extracts from Peel of fruit without fruit

The invention belongs to the technical field of extraction technology of effective components of natural products, in particular relates to a preparation method of active extracts from the fruit peel and its antifungal application. The soapberry peel crushing, solvent extraction, processing, and processing is concentrated, the concentrated liquid by D392 type weakly basic anion exchange resin column, followed by water and different concentrations of aqueous ethanol elution and eluate collection of ethanol water solution, will collect the elution solution was concentrated and dried, i.e. product. The purity of the active extract from the fruit peel obtained by the method is more than 95%, which has the advantages of low cost, simple operation, high purity, good activity, clear mechanism and non-toxic side effect. The active extract prepared from the preparation method of the fruit peel without the presence of the invention is applied to the antifungal drugs, and is especially suitable for the preparation of diseases caused by Candida albicans, Trichophyton rubrum and Candida albicans infection.

【技术实现步骤摘要】
无患子果皮活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用
本专利技术属于天然产物有效成分的提取工艺
，具体涉及一种无患子果皮活性提取物的制备方法及其抗真菌的应用。
技术介绍
由于各种抗生素的广泛应用、器官移植等技术的发展，真菌感染的患病率和致死率在全球呈上升趋势。根据侵犯人体部位的不同，可以将真菌感染性疾病分为浅表真菌感染，皮肤真菌感染，皮下组织真菌感染和系统性真菌感染。其中，浅表真菌感染和皮肤真菌感染统称为浅部真菌感染，皮下组织真菌感染和系统性真菌感染统称为侵袭性真菌感染。浅部真菌感染是致病真菌侵犯皮肤的角质层、毛发和甲板所导致的感染，主要致病菌为皮肤癣菌，其他常见致病菌还有马拉色菌和念珠菌等，直接接触是其主要传播方式。皮肤癣菌等主要致病菌来源于3个属，即小孢子菌属、毛癣菌属和表皮癣菌属，霉菌性阴道炎主要致病菌为念珠菌属。深部真菌感染主要由条件致病性真菌,如念珠菌属、曲霉属和隐球菌属所致,占造血干细胞移植、器官移植和其他免疫缺陷患者真菌感染的80％以上。由于各种高效广谱抗菌药物的广泛使用，病原微生物产生了多种耐药机制以保持物种的延续，而形成生物被膜就是一种重要的耐药机制。生物被膜是指大量微生物黏附于某些物体的表面形成的一种膜样聚集，具有复杂的三维结构和功能，目前认为人体80％微生物感染与病原微生物的生物被膜相关。生物被膜相关性感染会影响患者预后，临床研究表明由产生生物被膜念珠菌造成的念珠菌血流感染其致死率是由不产生生物被膜念珠菌造成的血流感染的1.77倍，生物被膜产生也是念珠菌血流感染患者死亡的独立危险因素。动物实验也表明，从生物被膜扩散的游离念珠菌较非生物被膜游离念珠菌具有更强的毒力，从而其感染可造成更差的结局。生物被膜相关性感染很难控制，因为其具有更强的耐药性，普通抗真菌药物治疗很难完全清除生物被膜。目前临床对念珠菌生物被膜尚无理想对策，如何防治和克服生物被膜耐药问题，已成为临床上极具挑战性的课题。无患子(SapindusmukorossiGaertn.)，又名油患子、木患子、洗手果、肥皂树等，属于无患子科无患子属落叶小乔木，广泛分布于我国淮河以南和东南亚地区，在我国主产于广东、广西。无患子始记载于《本草纲目》，具有清热祛痰、消积杀虫等作用。现代药理研究发现，无患子具有多种生理活性，主要包括抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、灭螺活性、杀虫活性、抗炎症、抗溃疡、保护心肌缺血、防血栓、杀精、保肝等。无患子果皮的主要化学成分为无患子活性部位，主要为常春藤皂苷元型三萜皂苷，具有很强的非离子表面活性作用，是优良的天然洗涤剂，所以目前关于无患子的大量研究主要集中在其清洁去污能力上。无患子在洗化用品上应用较多，其抗菌活性部位的提取方法主要包括水提法或有机溶剂提取法。虽然研究者们对无患子的分离提取做了不少工作，但总的来说都还处于初步研究阶段，要实现规模化生产还存在纯度低，如水提法，水提法的提取率较高，但是往往会将一些单糖、寡糖、氨基酸、蛋白质、黏液质等也被提取出来，从而导致提取物中的皂苷纯度降低，或是成本高、可操作性差等缺点。目前还有超滤法分离、微波提取等无患子活性部位提取工艺，但存在清洗苦难、溶剂损失大，纯度不高等缺点，因此很有必要对无患子活性部位提取工艺进行更深入的研究，以获得低成本、高纯度、操作简便、绿色环保的提取工艺，实现或完善无患子活性部位的工业化生产。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种无患子果皮活性提取物的制备方法，制备的无患子果皮活性提取物纯度达到95％以上，具有操作简便、适合工业化生产、纯度高、活性好、机制明确、无毒副作用的特点；本专利技术还提供一种将提取物应用于抗真菌药物中应用。本专利技术所述的一种无患子果皮活性提取物的制备方法，将无患子果皮粉碎，用溶剂处理，合并处理得到的提取液，浓缩，将浓缩液通过D392型弱碱性阴离子交换树脂柱，依次用水和不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液，将收集的洗脱液进行浓缩、干燥，即得产品。其中：优选地，依次用水和不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液为：依次用水、50±2％乙醇、75±2％乙醇、95％±2乙醇洗脱，收集50±2％乙醇、75±2％乙醇和95±2％乙醇洗脱液。其中50±2％乙醇代表浓度为48-52％的乙醇水溶液，其他类推。溶剂为水、乙醇水溶液、甲醇水溶液或丙酮水溶液。用溶剂处理为用溶剂超声处理或添加溶剂加热回流处理。用溶剂处理次数为至少3次，每次处理时溶剂添加重量是无患子果皮的8-12倍，每次处理时间为1.8-2.2小时。无患子果皮重量与树脂柱体积比为1:2，无患子果皮重量以g计，树脂柱体积以mL计；树脂柱的径高比为1:10。洗脱液流速为1个柱体积/小时。将无患子果皮粉碎为将无患子果皮烘干后粉碎，对粉碎后的粒径没有特别要求。由本专利技术所述的制备方法制备的无患子果皮活性提取物在抗真菌中的应用，无患子果皮活性提取物用于制备治疗真菌感染所致疾病、念珠菌感染所致疾病、白色念珠菌感染所致疾病、被膜念珠菌感染所致疾病、红色毛癣菌感染所致疾病、霉菌性阴道炎或体癣的药物。药物剂型为软膏剂、乳剂、洗剂或栓剂，药物中无患子果皮活性提取物的添加重量为1％～20％。一、对样品1-12抗真菌活性测试：最小抑菌浓度(MIC)测定方法：所用菌株为：白色念珠菌SC5314(野生型)、红色毛癣菌ATCC28188、黑曲霉菌ATCC16404。将菌株混悬于含20％甘油的生理盐水中，于-80℃长期保存。实验前，将菌株划线转接至YPD固体平板，30℃静置培养24h，将长出的单菌落转接至YPD液体培养基，30℃，200rpm过夜培养，将过夜培养的菌液以约1:100比例接种于新鲜的YPD培养基中，30℃振荡培养4h，此时白色念珠菌处于对数生长期，可用来进行后续实验。MIC值的确定是按照美国临床和实验标准协会(CLSI)所制定的真菌敏感性检测方法(M27-A3)，采用微量稀释的方法进行测定。具体实验步骤为：用RPMll640培养基将待测菌株菌浓度调整至0.5～2.5×103cells/mL：在96孔板第一个孔中加入200μl含有最高浓度待测药物的菌液，其余每孔各加入100μl不含药物的空白菌液；采用二倍梯度稀释的方法将菌液稀释至一系列浓度梯度；将孔板在35℃恒温静置培养24h。用酶标仪检测各浓度梯度在570nm处的吸光度(OD值)，扣除空白培养基吸光度后，以各孔OD值除以对照组OD值的比率为其生长率，以抑制率(1-生长率)大于80％的最小浓度为其最小抑菌浓度即MIC值。样品的制备：1、分别取无患子果皮100g，捡除杂质，将原料烘干，粉碎成粗粉；用水超声提取3次，每次加10倍量溶剂，提取时间为2小时，合并提取液，浓缩至适量；将浓缩液通过D392型树脂，无患子药材重量与树脂体积比为1:2，树脂柱的径高比为1:10，依次用水、50±2％乙醇、75±2％乙醇、95％±2乙醇洗脱，流速为1个柱体积/小时，收集乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥，即得产品，为样品1。2、分别取无患子果皮100g，捡除杂质，将原料烘干，粉碎成粗粉；用水超声提取3次，每次加10倍量溶剂，提取时间为2小时，合并提取液，浓缩至适量；将浓缩液通过D101型树脂，无患子药材重量与树脂体积比为1:2，树脂柱的径高比为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无患子果皮活性提取物的制备方法，其特征在于：将无患子果皮粉碎，用溶剂处理，合并处理得到的提取液，浓缩，将浓缩液通过D392型弱碱性阴离子交换树脂柱，依次用水和不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液，将收集的洗脱液进行浓缩、干燥，即得产品。

【技术特征摘要】
1.一种无患子果皮活性提取物的制备方法，其特征在于：将无患子果皮粉碎，用溶剂处理，合并处理得到的提取液，浓缩，将浓缩液通过D392型弱碱性阴离子交换树脂柱，依次用水和不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液，将收集的洗脱液进行浓缩、干燥，即得产品。2.根据权利要求1所述的无患子果皮活性提取物的制备方法，其特征在于：依次用水和不同浓度的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇水溶液的洗脱液为：依次用水、50±2％乙醇、75±2％乙醇、95％±2乙醇洗脱，收集50±2％乙醇、75±2％乙醇和95±2％乙醇洗脱液。3.根据权利要求1所述的无患子果皮活性提取物的制备方法，其特征在于：溶剂为水、乙醇水溶液、甲醇水溶液或丙酮水溶液。4.根据权利要求3所述的无患子果皮活性提取物的制备方法，其特征在于：用溶剂处理为用溶剂超声处理或添加溶剂加热回流处理。5.根据权利要求4所述的无患子果皮活性提取物的制备方法，其特征在于：用溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗得足，胡清文，焦启扬，曹桂东，曹燕，
申请(专利权)人：瑞阳制药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37