用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；还提供了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的探针，序列如SEQ ID No.3所示。还提供了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的试剂盒，含有用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；还含有用于检测犬粪中多房棘球绦虫的探针，序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术利用该引物和探针对多房棘球绦虫进行荧光定量PCR反应可有效扩增，可特异性地针对多房棘球绦虫感染情况进行鉴别诊断。

Primers, probes and kits for detection of Echinococcus granulosus in dog feces

The present invention provides a primer for detection of canine Echinococcus multilocular feces, the upstream primer sequence is shown as SEQ ID No.1; sequence downstream primer is shown as SEQ ID No.2; also provides a probe for detection of Echinococcus canine feces more real, the sequence is shown as SEQ ID No.3. Also provides a kit for detection of canine Echinococcus multilocular feces, containing primers for detection of canine feces of Echinococcus multilocularis, the upstream primer sequence is shown as SEQ ID No.1; sequence downstream primer is shown as SEQ ID No.2; also contains probes for detection of canine feces of Echinococcus multilocularis, the sequence is shown as SEQ ID No.3. The primer and probe fluorescence quantitative PCR reaction of Echinococcus multilocularis can be amplified by the invention, specifically for Echinococcus multilocularis infection diagnosis.

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种寄生虫的检测方法，具体来说是一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒。
技术介绍
多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)形态和生活史均与细粒棘球绦虫相似，但成虫主要寄生在狐，中间宿主是啮齿类或食虫类动物，幼虫期是多房棘球蚴(亦称泡球蚴)。在人体引起严重的泡球蚴病(alveococcosis)，亦称泡型包虫病(alveolarhydatiddisease)，或多房性包虫病(multilocularhydatiddisease)。多房棘球绦虫分布地区比细粒棘球绦虫局限，主要流行在北半球高纬度地区，从加拿大北部、美国阿拉斯加州，直至日本北海道、俄罗斯西伯利亚。遍及北美、欧、亚三洲的寒冷地区和冻土地带。多房棘球绦虫的泡球蚴为淡黄色或白色的囊泡状团块，常见多个大小囊泡相互连接、聚集而成。泡球蚴多以外生性出芽生殖不断产生新囊泡，长入组织，少数也可向内芽生形成隔膜而分离出新囊泡。一般1～2年即可使被寄生的器官几乎全部被大小囊泡占据。呈葡萄状的囊泡群带可向器官表面蔓延至体腔内，犹如恶性肿瘤。人泡球蚴病通常比细粒棘球蚴病更严重，病死率较高。目前，对犬类多房棘球绦虫感染的检测方法主要有剖检法、氢溴酸槟榔碱导泻法、粪抗原检测法和粪便DNA-PCR法。但这些方法都存在一定的缺点，如：剖检法需要剖杀犬只，可行性不大。氢溴酸槟榔碱泻下法工作难度大、耗时费力、工作人员易感染虫卵的潜在危险。粪抗原成分复杂，检测中常出现假阳性结果。传统的核酸扩增技术需要特殊训练的技术人员才能操作得到稳定可靠的结果，标本的处理、试剂制备、核酸扩增及检测需要在个别独立的空间进行。上述方法中，常规检测方法具有感染人和周围环境的危险，且检测过程复杂，耗费人力和时间。实时荧光定量PCR是聚合酶链式反应(PCR)的一种形式，其中数据随着反应进程实时采集。持续数据采集使得实时荧光PCR的主要应用之一为靶标定量。实时荧光定量PCR特异性好，灵敏度高，线性关系好，操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖,不易污染，同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒，所述的这种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒要解决现有技术中检测犬粪中多房棘球绦虫的过程复杂、耗费人力和时间的技术问题。本专利技术提供了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的序列如SEQIDNo.2所示；本专利技术还提供了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的探针，所述探针的序列如SEQIDNo.3所示；在所述的探针的5’端设置有荧光报告基团，3’端设置有荧光淬灭基团。进一步的，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为TAMRA。本专利技术还提供了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的序列如SEQIDNo.2所示；还含有用于检测犬粪中多房棘球绦虫的探针，所述探针的序列如SEQIDNo.3所示；在所述的探针的5’端设置有荧光报告基团，3’端设置有荧光淬灭基团。。进一步的，在所述的试剂盒中还包含2×PremixExTaqMasterMix、标准阳性模板、去离子水。进一步的，上游引物、下游引物和探针的浓度为10μmol/L。本专利技术根据多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因cox1(GenBankTMaccessionnumber:AB813188和MF004310)存在核苷酸序列差异(见下)来设计了荧光定量PCR引物和探针。该引物和探针针对多房棘球绦虫进行荧光定量PCR并得到特异性的曲线，利用该扩增区域多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫存在核苷酸序列差异，通过建立Taqman的实时荧光定量PCR方法对犬粪便中的多房棘球绦虫进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得的溶解曲线存在差异，可根据溶解曲线是否出现来直接对多房棘球绦虫感染情况进行诊断。本专利技术设计并合成了特异性引物和探针：EfF/EfR，EF。通过所述引物和探针建立基于Taqman的实时荧光定量PCR方法，根据该引物和探针扩增的多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫线粒体cox1基因所存在的核苷酸差异，可特异性地扩增多房棘球绦虫，产生特异的溶解曲线，直接对多房棘球绦虫感染进行鉴别。采用本专利技术的试剂盒进行检测时，先对多房棘球绦虫虫卵进行DNA的提取，从检测的犬粪便样本中分别提取多房棘球绦虫的DNA；然后以待测个体的基因组DNA为模板，分别利用特异性引物(EfF/EfR)和探针(EF)扩增多房棘球绦虫，配合实时荧光定量PCR在电脑并利用仪器自带的分析软件，可特异性地针对多房棘球绦虫感染情况进行鉴别诊断，根据扩增曲线结果判定待测个体的虫种。如果扩增曲线仅有EF探针起跳，则待测个体为多房棘球绦虫。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是积极和明显的。本专利技术采用Taqman荧光定量PCR技术，利用特异性的引物和探针可以高效准确的从被棘球绦虫感染的动物粪便中扩增出目的片段，检测犬粪中多房棘球绦虫的感染情况，为犬科类动物棘球绦虫病的诊断治疗提供便利。而且操作简便、快速高效、结果准确、成本可控。附图说明图1为本专利技术的多房棘球绦虫特异引物分别对常见寄生虫(牛带绦虫、猪带绦虫、蛔虫、钩虫、鞭虫、华支睾吸虫、大片吸虫、肝片吸虫)DNA模板进行荧光定量PCR扩增曲线结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW，MolecularCloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1用于区分犬粪中多房棘球绦虫的实时荧光定量PCR引物特异引物和探针的获得。根据多房棘球绦虫的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因cox1(GenBankTMaccessionnumber:AB813188)，采用PrimerExpress3.0软件设计并合成Taqman荧光定量PCR特异引物和探针，包括：一组特异性扩增多房棘球绦虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列为：上游引物EfF：5’-GATTCCTTCTTTAGTTTTGTTGTTGATTAG-3’，下游引物EfR：5’-CGAACTAAAAACTCTAGAAACACCTGCT-3’，探针EF：5’-F-TGGTTGGACTTTTTATCCTCCATTGTCTTCTTCA-Q-3’。其中，F为荧光报告基团FAM，Q为荧光淬灭基团TAMRA。实时定量PCR反应使用的扩增体系以25μL，优化出的最佳反应体系为：实时定量PCR反应使用的条件为：犬粪便基因组DNA的提取使用QIAampFastDNAStoolMiniKit试剂盒(购自Qiagen公司)。分别利用特异性引物(EfF/EfR)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的序列如SEQIDNo.2所示。2.一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQIDNo.3所示；在所述的探针的5’端设置有荧光报告基团，3’端设置有荧光淬灭基团。3.根据权利要求1所述的一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的探针，其特征在于：所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为TAMRA。4.一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈家旭，肖宁，陈韶红，艾琳，陈木新，田利光，储言红，卢艳，蔡玉春，吴秀萍，俞英昉，宋鹏，陈海宁，李浩，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：上海,31