一种固定化β‑葡萄糖苷酶及其制备方法和应用技术

一种固定化β‑葡萄糖苷酶及其制备方法和应用，步骤为（1）大孔树脂预处理；（2）大孔吸附树脂NKA‑9聚醚酰亚胺表面改性；（3）大孔树脂吸附β‑葡萄糖苷酶；（4）戊二醛交联反应修饰。本发明专利技术首次利用金属离子Zn

【技术实现步骤摘要】
一种固定化β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用
本专利技术属于酶工程和生物工程应用领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用，尤其涉及β‐葡萄糖苷酶的固定化方法及利用Zn2+提高其固定化酶催化能力及酶学特性的方法应用。
技术介绍
β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase，EC3.2.1.21)属于外切水解酶类，又称β‐D‐葡萄糖苷水解酶，可以在短链的纤维寡糖或纤维二糖内部打断β‐1，4‐糖苷键，也可以在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β‐1，4‐糖苷键，因而被广泛应用纤维素水解、黄酮类化合物和皂苷类等天然活性物质的生物催化和转化等领域。但制约着β‐葡萄糖苷酶规模化应用的主要障碍是酶的使用成本高。一是游离酶只能使用一次，而且在实际使用环境下，酶的温度和pH等酶学性质不稳定，酶易失活。解决这一问题的有效途径之一是将酶固定化。酶的固定化不仅能显著提高酶的使用次数，而且固定化酶的酶学特性会有不同程度的改善。酶的固定技术包括物理吸收法，包埋法和共价结合法等。其中载体和蛋白质之间通过简单吸附作用固定酶蛋白，优势在于不会破坏酶蛋白的空间构象以及活性位点，但缺点在于载体和酶之间的结合非常弱，酶易泄漏丢失。解决这一难题可以从以下几个方面来实现：(1)不同的吸附材料具有不同的吸附能力，不同的酶也具有不同的被吸附的特性。要针对特定的酶，选择吸附能力强的固定化材料。研究表明，在许多固定化酶载体中，大孔吸附树脂具有相对较大的比表面积和孔径，具有很好的热稳定性。(2)对大孔树脂进行修饰、改造，集成包埋法等酶固定化方法，提高载体和酶之间的结合力。(3)通过筛选，引入固定化酶的激活剂、稳定剂等。目前，随着研究的深入和应用领域的拓宽，GH3家族的β‐葡萄糖苷酶(如来源于ThermotogapetrophilaDSM13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶Tpebgl3)、GH1家族的β‐葡萄糖苷酶(如来源于ThermotogapetrophilaDSM13995来源的GH1家族的β‐葡萄糖苷酶)相继被开发利用，它们具有优良的催化特性，其基因重组菌也实现了较高水平的表达，在植物纤维原料糖化、天然活性物质生物催化与转化等领域中具有很大的应用潜力。但这些酶还不能满足工业化应用的需求，主要表现在pH稳定性，糖的耐受性、温度稳定性等方面性质还需改善，而且酶的使用成本偏高。本专利技术在通过大量筛选，获得优良的固定β‐葡萄糖苷酶的大孔树脂NKA‐9的基础上，通过利用化学试剂聚醚酰亚胺(PEI)对大孔树脂NKA‐9进行修饰和改造，利用戊二醛作为交联剂，制备固定化酶，并通过大量筛选，引入金属离子Zn2+作为固定化酶的激活剂。专利技术的β‐葡萄糖苷酶固定化技术显著提高了来源于ThermotogapetrophilaDSM13995等微生物的GH3、GH1家族的β‐葡萄糖苷酶的酶催化活力和重复利用次数，显著改善了固定化酶的热稳定性和在溶液中的pH稳定性，有效提高了固定化酶的耐糖能力。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供了一种固定化β‐葡萄糖苷酶及其制备方法和应用，具体为利用大孔吸附树脂NKA‐9固定GH3、GH1β‐葡萄糖苷酶和利用金属离子Zn2+提高固定化酶催化能力及改善固定化酶酶学特性的方法。技术方案：一种固定化β‐葡萄糖苷酶的制备方法，步骤为：(1)大孔树脂预处理：通过加入乙醇，盐酸和氢氧化钠对大孔树脂进行预处理，除去杂质和污染物；(2)大孔吸附树脂NKA‐9聚醚酰亚胺表面改性：将质量浓度不超过12％的聚醚酰亚胺加入大孔树脂中反应，反应后利用去离子水洗涤；按比例，在100mLpH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺质量浓度为8％，树脂量为50g，此时，β‐葡萄糖苷酶蛋白吸附量最高；(3)大孔树脂吸附β‐葡萄糖苷酶：将β‐葡萄糖苷酶与聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂混合，进行吸附作用；按比例，在100mLpH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂质量为10g，β‐葡萄糖苷酶蛋白浓度为0.5mg/mL；(4)戊二醛交联反应修饰：将质量浓度不超过2.0％的戊二醛加入到利用聚醚酰亚胺改性后并吸附了β‐葡萄糖苷酶的大孔树脂混合，反应后利用去离子水涤，按比例，在100mL的反应体系中，戊二醛质量浓度为0.25％，吸附β‐葡萄糖苷酶的聚醚酰亚胺修饰的树脂质量为10g。优选的，上述步骤(1)具体处理方法为：按比例，首先将20g大孔树脂加入到含有100mL的无水乙醇中浸泡24小时，然后用去离子水反复洗涤至无乙醇气味残留；然后将处理过的大孔树脂浸泡在含5wt.％盐酸的100mL溶液中4h，接着利用去离子水将树脂洗涤至中性pH；接着将洗涤干净的树脂浸入含100mL1M氢氧化钠溶液中浸泡4小时，继续用去离子水将树脂洗涤至中性pH。优选的，上述大孔树脂为NKA‐9。优选的，上述聚醚酰亚胺的质量浓度为8％。优选的，上述戊二醛的质量浓度为0.25％。优选的，上述β‐葡萄糖苷酶为ThermotogapetrophilaDSM13995等来源的GH3家族、GH1家族等家族的β‐葡萄糖苷酶。优选的，上述制备方法制备得到的固定化β‐葡萄糖苷酶。优选的，上述固定化β‐葡萄糖苷酶的应用，反应体系中含有Mn2+或Zn2+。优选的，反应体系为200μL，含10μL100mM纤维二糖，190μL100mM的pH5.0柠檬酸Na2HPO4缓冲液，10mg的固定化酶，Mn2+或Zn2+的浓度为1～3mM。优选的，上述Zn2+的浓度为2mM。有益效果：1、本专利技术利用特定浓度的聚醚酰亚胺(PEI)处理的大孔树脂NKA‐9固定β‐葡萄糖苷酶。然后利用特定浓度的戊二醛作为固定化的交联剂制备固定化酶。固定来源于ThermotogapetrophilaDSM13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶时，该固定化酶NKA‐9II的最适反应温度为85‐90℃，最适pH为5.0。该固定化酶的热稳定性、pH稳定性和葡萄糖耐受性相比游离酶有着显著提高。在Zn2+参与的条件下，固定化酶在重复利用10次，其固定化酶的剩余酶活力保持在78％以上。2、本专利技术首次利用金属离子Zn2+作为利用大孔吸附树脂固定化β‐葡萄糖苷酶的激活剂、热稳定剂。相比未加Zn2+制备的固定化酶，Zn2+的参与使固定ThermotogapetrophilaDSM13995GH1家族的β‐葡萄糖苷酶的的催化效率提高了20％以上；使固定化酶NKA‐9II的催化效率提高了92％以上。相对于起始酶活，Zn2+的参与，在85℃条件下，温育7h，固定化酶NKA‐9II的酶活还保持在80％以上；90℃条件下温育7h，固定化酶NKA‐9II的酶活还保持在54％以上。3、本专利技术首次在固定化酶NKA‐9II中加入金属离子Zn2+，能有效提高固定化酶的葡萄糖耐受性，在Zn2+加入的条件下，在葡萄糖浓度为400mM时，固定酶NKA‐9II的相对酶活力保持在63％以上。附图说明图1：聚醚酰亚胺(PEI)的浓度对大孔树脂固定T.DSM13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶效果的影响。图2：戊二醛浓度对大孔树脂固定T.DSM13995GH3家族的β‐葡萄糖苷酶效果的影响。图3：固定化酶NKA‐9II的最适反应温度。图4：固定化酶NKA‐9II的最适反应pH。图5：固定化酶NKA‐9II本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化β‑葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于步骤为：（1）大孔树脂预处理：通过加入乙醇，盐酸和氢氧化钠对大孔树脂进行预处理，除去杂质和污染物；（2）大孔吸附树脂NKA‑9聚醚酰亚胺表面改性：将质量浓度不超过12%的聚醚酰亚胺加入大孔树脂中反应，反应后利用去离子水洗涤；按比例，在100mL pH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺质量浓度为8%，树脂量为50g；（3）大孔树脂吸附β‑葡萄糖苷酶：将β‑葡萄糖苷酶与聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂混合，进行吸附作用；按比例，在100mL pH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂质量为10g，β‑葡萄糖苷酶蛋白浓度为0.5mg/mL；（4）戊二醛交联反应修饰：将质量浓度不超过2.0%的戊二醛加入到利用聚醚酰亚胺改性后并吸附了β‑葡萄糖苷酶的大孔树脂混合，反应后利用去离子水涤，按比例，在100mL的反应体系中，戊二醛质量浓度为0.25%，吸附β‑葡萄糖苷酶的聚醚酰亚胺修饰的树脂质量为10g。

【技术特征摘要】
1.一种固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于步骤为：（1）大孔树脂预处理：通过加入乙醇，盐酸和氢氧化钠对大孔树脂进行预处理，除去杂质和污染物；（2）大孔吸附树脂NKA-9聚醚酰亚胺表面改性：将质量浓度不超过12%的聚醚酰亚胺加入大孔树脂中反应，反应后利用去离子水洗涤；按比例，在100mLpH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺质量浓度为8%，树脂量为50g；（3）大孔树脂吸附β-葡萄糖苷酶：将β-葡萄糖苷酶与聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂混合，进行吸附作用；按比例，在100mLpH值4.5的反应体系中，聚醚酰亚胺修饰的大孔树脂质量为10g，β-葡萄糖苷酶蛋白浓度为0.5mg/mL；（4）戊二醛交联反应修饰：将质量浓度不超过2.0%的戊二醛加入到利用聚醚酰亚胺改性后并吸附了β-葡萄糖苷酶的大孔树脂混合，反应后利用去离子水涤，按比例，在100mL的反应体系中，戊二醛质量浓度为0.25%，吸附β-葡萄糖苷酶的聚醚酰亚胺修饰的树脂质量为10g。2.根据权利要求1所述固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于所述步骤（1）具体处理方法为：按比例，首先将20g大孔树脂加入到含有100mL的无水乙醇中浸泡24小时，然后用去离子水反复洗涤至无乙醇气味残留；然后将处理过的大孔树脂浸泡在含5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，石学佳，萧伟，王振中，李琦，
申请(专利权)人：南京林业大学，江苏康缘药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32