一种植物细胞规模培养方法技术

本发明专利技术涉及一种植物细胞规模培养方法。本发明专利技术公开了一种体外规模化悬浮培养扩增铁皮石斛细胞的方法，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，待愈伤组织长出后或胚状体诱导出后，将其剥离扩增，扩增后将愈伤组织/胚状体进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，摇床培养，经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增10‑25天，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标、植物生长调节剂浓度及比例、更换培养基成分等手段，最终达到每20‑50天收获一次，或者连续、半连续收获，多糖含量达到20％以上，并保持常年稳定扩增的从20L‑吨级单元的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。

【技术实现步骤摘要】
一种植物细胞规模培养方法
本专利技术属于植物组织工程
本专利技术涉及一种植物生物技术克隆工程，特别是针对银杏、红豆杉、铁皮石斛、丹参等药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，以及具有某些药用成分的蔬菜瓜果，例如西瓜，苦瓜等，或者对土地破坏比较严重，例如甘草等植物。
技术介绍
随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名贵中药材资源枯竭和濒灭。特别是针对像银杏、红豆杉、铁皮石斛这种药用价值很高却生长缓慢、产量极低、对环境条件要求十分苛刻的濒危物种，其社会效益很大。另一方面，由污染导致的食品安全问题已非常严重，农药残留和重金属超标是中草药植物的一大问题，也亟需解决。随着现代科技进步，植物组织工程方法的优势越来越明显，首先，这种方法不占用土地，节约了耕地资源；其次，不受天气状况影响，产量稳定；第三，无农残重金属残留；第四，可通过人为调整改变目标物质的含量。因此，在污染日益严重，土地资源匮乏的现代社会，通过植物组织工程的高科技手段生产出有效成分含量稳定、过程可控、不消耗过多土地资源的植物原料是大势所趋。本专利技术根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。针对银杏、红豆杉、铁皮石斛、丹参、西瓜、苦瓜等具体物种，专利技术了一整套从原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出愈伤组织，直接用愈伤组织或用诱导出的植物愈伤组织进行单细胞悬液制备，再利用组织工程技术对该细胞进行悬浮式的工业化大规模扩增，进而将该方法与人工光源相结合，利用控制温度、酸碱度、氧含量、以及生长调节剂比例等将生产规模扩大到吨级以上的规模。利用本专利技术的植物悬浮细胞规模培养工艺，其生长速率达到9-50毫克/克·天；相当于自然生长速度的数百甚至数千倍。利用规模化培养基础罐(50升)每7-50天产量可达2-20公斤干品，扩增产能每罐得率均在2.5-25％以上，得干率lO％以上。通过实施本专利技术的技术工艺，使中药材及某些有疗效的蔬菜水果的生物培养规模从土地种植的低水平向工厂化生产规模转化。同时，由于生产流程得到了良好的控制，使农残重金属几乎检测不到，大大提高了产品长期服用的安全性。
技术实现思路
本专利技术为一种体外规模化悬浮培养扩增细胞的工艺，其培养过程是：植物带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待愈伤组织长出后，将愈伤组织剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上以90-120转/分进行震荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增10-25天，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标、光源强度及比例、更换培养基成分、以及分批在线收集等手段，最终达到每20-60天收获一次，或者连续、半连续收获，比生物生长速率达9-50毫克/克·天，并保持常年稳定扩增的从20L-吨级单元的大规模植物细胞悬浮培养连续扩增体系。附图说明具体操作为：植物带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待起始胚状体长出后，将胚状体剥离，或待愈伤组织形成后直接剥离愈伤组织，经匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，置于摇床上90-120转/分振荡悬浮培养，获得细胞种子；将细胞种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照12-20h，光照强度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-15天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15-25天收获石斛胚状体培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，总浓度为在0.05-5mg/L调整。所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培养基。所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT0.05-3mg/L，总浓度为0.05-5mg/L。优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为IAA/NAA/IBA0.05-3mg/L:KT0.05-3mg/L:ABA0.05-50ug/L，总浓度为0.05-5mg/L。本专利技术为一种体外规模化悬浮培养扩增铁皮石斛细胞的工艺，其培养过程是：石斛带休眠芽茎段，插入到适宜固体培养基上，在合适的培养温度和光照强度下，待愈伤组织长出后，将愈伤组织剥离，置于相同的上述培养基上扩增，扩增后将愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，置于摇床上以90-120转/分进行震荡悬浮培养，每瓶按适当接种率接种，根据生长情况继代；经数次继代适应悬浮培养后，转入大规模生物反应器中进行连续扩增10-25天，待达到生长密度后，通过调节生物反应器中的指标、更换培养基成分、以及分批在线收集等手段，最终达到每20-50天收获一次，或者连续、半连续收获，多糖含量达到20％以上，比生物生长速率达9-12毫克/克·天，并保持常年稳定扩增的从20L-吨级单元的大规模铁皮石斛细胞悬浮培养连续扩增体系。培养周期结束后，培养物可一次性收获，或按20％-80％收获率保存种源作连续培养。附图说明附图1，附图简要以流程形式归纳了
技术实现思路
所涵盖的技术要点，悬浮培养植物细胞生产方法流程图。具体实施方式采集植物茎段，灭菌后以幼嫩茎接种到固体培养基上段诱导外植体，在愈伤阶段或者待胚状体诱导形成后，转移到以MS培养基为基础培养基，每升加入5-10克椰汁/苹果汁/香蕉汁，调节pH值至5.8的液体培养基中进行悬浮培养，培养条件：温度(25±5)℃，光强为2000-8000lx，光照时间12-20h/天。待胚状体适应悬浮培养后，将胚状体或愈伤组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，继续悬浮培养至稳定增值体系，按10-30％接种至大规模生物反应器中，培养周期为25-60天，或者连续培养。红蓝光比例前一段周期是2-3:4-5，后一段红蓝光比例为3-4:4-6，每阶段交替变换，每一阶段培养时间为10-15天，光强范围为2000-8000lx。大规模生物反应器中的培养基为基本培养基中加入了一定比例混合的生长素、细胞分裂素或者生长素、细胞分裂素以及脱落酸，生长素可以是IAA，IBA，NAA，细胞分裂素可以是6-BA，KT，ZT，脱落酸为ABA。生长素浓度为0.05-5mg/L，细胞分裂素浓度为0.05-5mg/L，ABA浓度为0.01-2mg/L。培养基在10-25天时换液一次，换液前后生长素与细胞分裂素组合均为：IAA/NAA/IBA0.05-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外规模化悬浮培养扩增植物细胞的方法，其培养过程是：将植物愈伤组织使用常规方法进行扩增培养，得到扩增后的愈伤组织或胚状体，将愈伤组织或胚状体组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，将细胞种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30‑50％之间，pH为5‑7，固定光源光照10‑20h，光照强度2000‑8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10‑25天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2‑3:4‑5调整为第二阶段的3‑4:4‑6，再由第二阶段的3‑4:4‑6调整为第三阶段的2‑3:4‑5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15‑25天收获植物细胞系培养物的30‑50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，生长素与细胞分裂素比例控制在3:1，总浓度在0.05‑5mg/L调整。

【技术特征摘要】
1.一种体外规模化悬浮培养扩增植物细胞的方法，其培养过程是：将植物愈伤组织使用常规方法进行扩增培养，得到扩增后的愈伤组织或胚状体，将愈伤组织或胚状体组织进行匀浆酶解、研磨或喷雾等理化手段分解为单细胞悬液，将细胞种子按一定接种比例接种到生物反应器中，通过调节氧含量在30-50％之间，pH为5-7，固定光源光照10-20h，光照强度2000-8000Lx，培养分阶段进行，每一阶段为10-25天，不同阶段的光质交替变换，所述的光质为红蓝光，所述的交替变换为红蓝光比例由第一阶段的2-3:4-5调整为第二阶段的3-4:4-6，再由第二阶段的3-4:4-6调整为第三阶段的2-3:4-5，并以此模式循环；每阶段更换新鲜液体培养基一次。每15-25天收获植物细胞系培养物的30-50％，并补充相应比例的新鲜液体培养基，培养持续进行；所述液体培养基为基本培养基中添加植物生长调节剂，植物生长调节剂为生长素、细胞分裂素的组合或生长素、细胞分裂素与ABA的组合，生长素与细胞分裂素比例控制在3:1，总浓度在0.05-5mg/L调整。2.根据权利要求1所述的方法，所述基本培养基为MS、1/2MS、1/4MS、B5、N6、NLN、White或SH培养基。3.根据权利要求1所述的方法，所述的液体培养基与更换的新鲜液体培养基中的植物生长调节剂相同，均为IAA/NAA/IBA0.05-3mg/L:6-BA/KT/ZT0.05-3mg/L，总浓度为0.05-5mg/L。4.根据权利要求1所述的方法，优选的，更换的新鲜液体培养基中植物生长调节剂为IAA/NAA/IBA0.05-3mg/L:KT0.05-3mg/L:ABA0.05-50ug/L，总浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，
申请(专利权)人：张杰，
类型：发明
国别省市：北京,11