一种多功能载体的构建及使用方法技术

本发明专利技术公开了一种多功能载体的构建及使用方法。该多功能载体含有DNA片段A(自5’端到3’端依次含attL1、IIs型限制性内切酶A的识别序列、筛选标签序列1、所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、attL2)和DNA片段B(自5’端到3’端依次含T‑DNA右边界序列、ColE ori序列、筛选标签序列2、pSa ori序列、T‑DNA左边界序列)。该多功能载体采用Golden Gate法可将单个或多个片段“无逢”插入载体中，操作简单经济；由于载体尺寸小，既可通过农杆菌稳定转化植株，也可瞬时转化原生质；由于含attL序列，因此可将其作为入门载体把重组片段通过LR反应穿梭至目的载体，应用灵巧便捷。

Construction and application of a multifunctional vector

The invention discloses the construction and use method of a multifunctional carrier. The multifunctional vector containing the DNA fragment of A (from the 5 'end to the 3' end sequence containing attL1 and IIs type A restriction endonuclease recognition sequences, screening label sequence 1, the IIs type A restriction endonuclease recognition sequences, attL2 and DNA (B) fragment from the 5 'end to the 3' end sequence with T DNA ColE ori right boundary sequence, sequence, sequence 2, pSa screening label ori sequence, T DNA left border sequence). The multifunctional carrier can be single or multiple \seamless\ fragment inserted into the vector using Golden Gate method, simple and economical; because the carrier of small size, can be transformed into plants by Agrobacterium is stable, can also be due to transient transformation protoplasm; containing attL sequence, it can be used as the entry vector recombinant fragment through the LR reaction to the shuttle vector, smart and convenient application.

【技术实现步骤摘要】
一种多功能载体的构建及使用方法
本专利技术属于基因工程和分子生物学领域，涉及一种多功能载体的构建及使用方法，具体涉及兼具植物双元目的载体和Gateway入门载体特征的pSPE的构建方法及其应用。
技术介绍
近年来随着基因测序技术的快速发展，许多植物基因组测序已经完成，这为进一步的基因功能研究提供了巨大的便利和基础。基因功能的研究离不开基因DNA片段的克隆和植物基因的转化。便捷高效的植物转化载体在植物基因功能的研究中非常重要。农杆菌介导的双元载体在植物转化中扮演着重要的角色。其中，基于pCambia骨架的系列载体是应用非常广泛的双元载体。它是根据Ti质粒改造的载体。野生型的Ti质粒中，既包括要转进植物的T-DNA片段，又包括基因转移所需的Vir基因等等，质粒非常大，有几百kb，不利于克隆构建等分子操作。在利用pCambia载体转化植物时，将vir基因等基因转移所需要的不用改变的部分放在一个大质粒上，转到农杆菌菌体里不用再动，而把T-DNA部分构件到pCambia骨架上。这样，需要进行克隆等分子操作的载体部分较小，大多pCambia骨架载体都在7-12kb左右。除此之外，pCambia载本文档来自技高网...

【技术保护点】
多功能载体，为含有DNA片段A和DNA片段B的环形载体；所述DNA片段A自5’端到3’端依次含有attL1序列、IIs型限制性内切酶A的识别序列、筛选标签序列1、所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、attL2序列；所述DNA片段B自5’端到3’端依次含有T‑DNA的右边界序列、大肠杆菌复制起点ColE ori序列、筛选标签序列2、农杆菌复制起点pSa ori序列、T‑DNA的左边界序列。

【技术特征摘要】
1.多功能载体，为含有DNA片段A和DNA片段B的环形载体；所述DNA片段A自5’端到3’端依次含有attL1序列、IIs型限制性内切酶A的识别序列、筛选标签序列1、所述IIs型限制性内切酶A的识别序列、attL2序列；所述DNA片段B自5’端到3’端依次含有T-DNA的右边界序列、大肠杆菌复制起点ColEori序列、筛选标签序列2、农杆菌复制起点pSaori序列、T-DNA的左边界序列。2.根据权利要求1所述的多功能载体，其特征在于：所述IIs型限制性内切酶A为BsaI；和/或所述筛选标签序列1为CmR-ccdB；所述CmR-ccdB为自5’端到3’端依次含有CmR和ccdB的DNA片段；所述CmR表示氯霉素抗性基因，所述ccdB表示ccdB致死基因；和/或所述筛选标签序列2为壮观霉素抗性基因序列。3.根据权利要求1或2所述的多功能载体，其特征在于：所述attL1序列为序列表中序列1的第32-131位；和/或所述CmR-ccdB的序列为序列表中序列1的第312-1565位；和/或所述attL2序列为序列表中序列1的第1658-1757位。4.根据权利要求1-3中任一所述的多功能载体，其特征在于：所述壮观霉素抗性基因序列为序列表中序列1的第2723-3511位；和/或所述大肠杆菌复制起...

【专利技术属性】
技术研发人员：娜仁，杨春燕，张孟臣，刘兵强，赵青松，陈强，
申请(专利权)人：河北省农林科学院粮油作物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13