一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法及其应用，包括以下步骤：（1）将基材抛光清洗后用NaOH活化，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥；（2）基材用多赖氨酸处理；（3）将SEMA4D溶液与肝素溶液等体积混合，反应得到SEMA4D/Heparin复合物；（4）基材浸入步骤（3）得到SEMA4D/Heparin复合物修饰的基材；（5）基材再次浸入CXCL12溶液中，反应后PBS清洗后既得目标产物；本发明专利技术能较好的模拟机体时序应答血管原位内皮化进程，含有的生物因子，能协同促进原位内皮化进程；多种因子协同发挥作用，并且制备方法简单，适用性强。

【技术实现步骤摘要】
一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法及其应用
本专利技术涉及心血管植入物、心血管辅助装置的表面生物改性方法，具体涉及一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法及其应用。
技术介绍
原位内皮化可以通过两种方式实现，当植入物表面在未接种内皮细胞(ECs)情况下，可以通过促进周围血管组织的ECs迁移、粘附和增殖方式在植入物表面形成一层抗凝的内皮层；另一种是通过动员和捕获外周血中的内皮祖细胞(EPCs)到植入物表面；粘附、增殖并最后分化成ECs，从而促进内皮层的形成；同时这些EPCs也参与血管组织的损伤修复及血管重建；促进EPCs动员、归巢及分化的细胞因子和趋化因子有很多，例如CSF3、辛伐他汀(simvastatin)、CCL2、EPO、TYMP、EGF、CXCL12(C-X-C趋化因子配体12，即SDF-1α)；其中CXCL12是一种广泛使用的促进EPC动员、归巢及分化成EC的趋化因子；可溶性Semaphorin4D(SEMA4D)是一种促进EC迁移的细胞因子，能促进血管形成的发生。肝素(Heparin)是细胞外基质(ECM)中广泛存在的葡萄糖胺聚糖，通过戊多糖结构与抗凝血酶结合，抑制凝血酶活性，进而抑制纤维蛋白及相关凝血因子形成，临床上常被用作抗凝剂；主要用于治疗血栓症、血栓静脉炎及血栓栓塞症；肝素结构中含有大量的硫酸根基团，是目前发现的负电性最强的生物分子，这种强负电性使得肝素还能结合多种蛋白、血小板、ECs以及其他循环细胞，发挥促血管形成或抗血管形成的作用；但是肝素的促血管形成或抗血管形成作用强烈依赖于结合的蛋白种类，当与血管生成因子、纤维母细胞生长因子(FGFs)、胎盘生长因子(PIGF)、组织因子(TF)以及血管内皮生长因子A(VEGFA)等蛋白结合时将发挥促血管形成作用；但当与血管他丁、内皮他丁、干扰素-γ-诱导蛋白-10(IP-10)、血小板反应素Ⅰ和Ⅱ(TSP-Ⅰ和TSP-Ⅱ)结合时将产生抗血管形成的作用；当血管受损时，激活的血小板能够释放1000多种活性分子，其中包含SEMA4D和CXCL12；作为细胞外基质(ECM)的构成组分，在正常生理状态下肝素有机会同时和SEMA4D、CXCL12结合而产生相应的生理学功能；肝素能够促进成血管生长因子和相应受体间的识别与结合，激活相应的受体信号通路，从而促进体内血管移植表面的内皮化；目前还没有发现将肝素同时与SEMA4D和CXCL12结合用于心血管材料的技术。
技术实现思路
本专利技术提供一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法及其应用。本专利技术采用的技术方案是：一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法，包括以下步骤：(1)将基材抛光清洗后用2-3mol/L的NaOH活化8-16h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥；(2)将步骤(1)中经过处理的基材用2-5mg/ml的多赖氨酸，在4℃条件下浸没处理12h，PBS清洗后待用；(3)将浓度为100-400ng/ml的SEMA4D溶液与浓度为10mg/ml的Heparin肝素溶液等体积混合，37℃条件下反应1-3h得到SEMA4D/Heparin复合物；(4)将步骤(2)中处理的基材浸入步骤(3)得到的SEMA4D/Heparin复合物中，在4℃条件下反应12-24h后将基材进行清洗；(5)将步骤(4)中的基材浸入200-400ng/ml的CXCL12溶液中，在4℃条件下反应12-24h，PBS清洗后既得目标产物。进一步的，所述基材包括钛及钛合金。进一步的，所述涂层的应用，用于心血管植入器械表面。进一步的，所述涂层的应用，用于抗凝。进一步的，所述涂层的应用，用于促进血管的原位内皮化。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术能够较好的模拟机体时序应答血管原位内皮化进程，肝素作为抗凝剂能够抑制体内血栓形成，抑制血小板和纤维蛋白在材料表面的激活和粘附；SEMA4D、CXCL12分子均为血小板激活后所释放的促进内皮再生的生物因子，具有协同促进内皮化的作用，能够促进快速原位内皮化；(2)本专利技术将肝素和多种因子结合并固定在材料表面，肝素能延缓生物因子的半衰期，生理环境下能够对生物因子起到保护，避免生物因子被蛋白酶降解，同时促进生物因子与受体间的识别与结合，保证生物因子功能的发挥；(3)本专利技术制备工艺简单、易于操作、无需昂贵复杂的设备，适用于各种复杂的心血管植入器械如血管支架、血栓滤器等具有抗凝/促进内皮迁移要求的表面。附图说明图1为本专利技术涂层制备流程示意图。图2为本专利技术中实施例1制备的涂层与对比例1的XPS图谱。图3为本专利技术中实施例1制备的涂层与对比例1的XPS中C1s的高分辨图谱。图4为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2血小板粘附情况的荧光显微镜图。图5为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2血小板粘附情况的SEM图。图6为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2表面内皮细胞迁移的荧光图。图7为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2对内皮祖细胞捕获的荧光显微图。图8为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2对内皮祖细胞捕获的SEM图。图9为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2植入体内的苏木精-伊红(HE)染色图。图10为本专利技术实施例1制备的涂层与对比例1和对比例2植入体内后的免疫荧光图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明。如图1所示，一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法，包括以下步骤：(1)将基材抛光清洗后用2-3mol/L的NaOH活化8-16h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥；(2)将步骤(1)中经过处理的基材用2-5mg/ml的多赖氨酸(PLL，MW150-300KDa)，在4℃条件下浸没处理12h，PBS清洗后待用；(3)将浓度为100-400ng/ml的SEMA4D溶液与浓度为10mg/ml的Heparin肝素溶液等体积混合，37℃条件下反应1-3h得到SEMA4D/Heparin复合物；(4)将步骤(2)中处理的基材浸入步骤(3)得到的SEMA4D/Heparin复合物中，在4℃条件下反应12-24h后将基材进行清洗；(5)将步骤(4)中的基材浸入200-400ng/ml的CXCL12溶液(溶剂为pH＝7.4的PBS)中，在4℃条件下反应12-24h，PBS清洗后既得目标产物。进一步的，所述基材包括钛及钛合金。进一步的，用于心血管植入器械表面。进一步的，用于抗凝。进一步的，用于促进血管的内皮化进程。实施例1一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法，包括以下步骤：(1)将纯钛基材抛光清洗后用2-3mol/L的NaOH活化8-16h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥；(2)将步骤(1)中经过处理的基材用2mg/ml的多赖氨酸(PLL，MW150-300KDa)，在4℃条件下浸没处理12h，PBS清洗后待用；(3)将浓度为200ng/ml的SEMA4D溶液与浓度为10mg/ml的He本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将基材抛光清洗后用2‑3mol/L的NaOH活化8‑16h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥；(2)将步骤(1)中经过处理的基材用2‑5mg/ml的多赖氨酸，在4℃条件下浸没处理12h，PBS清洗后待用；(3)将浓度为100‑400ng/ml的SEMA4D溶液与浓度为10mg/ml的Heparin肝素溶液等体积混合，37℃条件下反应1‑3h得到SEMA4D/Heparin复合物；(4)将步骤(2)中处理的基材浸入步骤(3)得到的SEMA4D/Heparin复合物中，在4℃条件下反应12‑24h后将基材进行清洗；(5)将步骤(4)中的基材浸入200‑400ng/ml的CXCL12溶液中，在4℃条件下反应12‑24h，PBS清洗后既得目标产物。

【技术特征摘要】
1.一种SEMA4D和CXCL12双分子协同促原位内皮化涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将基材抛光清洗后用2-3mol/L的NaOH活化8-16h，单蒸水超声清洗后浸入双蒸水，80℃下反应12h，单蒸水超声清洗后，干燥；(2)将步骤(1)中经过处理的基材用2-5mg/ml的多赖氨酸，在4℃条件下浸没处理12h，PBS清洗后待用；(3)将浓度为100-400ng/ml的SEMA4D溶液与浓度为10mg/ml的Heparin肝素溶液等体积混合，37℃条件下反应1-3h得到SEMA4D/Heparin复合物；(4)将步骤(2)中处理的基材浸入步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊英，崔园园，周丰，牟小辉，谭建英，曾峥，魏来，彭行溉，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川,51