一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种降低核桃外植体褐变率的培养基，包括蛭石和培养液；并且公开了一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，于上述培养基中进行初代培养，并转接于培养液的琼脂培养基中进行继代培养。本发明专利技术培养基及培养方法防止核桃外植体褐化的效果显著，且适用于多种核桃品种，应用范围广，利于提高组培繁殖的成活率，加速良种及良砧无性苗的繁育。

A medium for reducing browning rate of walnut explants and its culture method

The invention discloses a method for reducing medium browning rate of walnut explants, including vermiculite and medium; and discloses a method for reducing cultivation of walnut explants browning rate, in the culture medium for primary culture, and transferred to the medium agar medium for subculture. The culture medium and culture method to prevent the effect of walnut explants browning significantly, and is applicable to a variety of walnut varieties, wide application range, can improve the survival rate of tissue culture propagation, accelerate seed seedling breeding and good anvil clones.

【技术实现步骤摘要】
一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法
本专利技术涉及植物组织培养领域，具体地说，涉及一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法。
技术介绍
核桃(JuglansregiaL.)别名胡桃、羌桃，属于胡桃科核桃属植物，是一种优良的干果树种，具有极高的经济价值与营养价值。目前，核桃的无性繁殖普遍采用嫁接的方法，其繁殖系数低、速度慢，成活率不稳定且易受穗条数量限制，导致不少地区仍采用实生苗进行繁殖培育，严重限制了核桃的商业性生产；因此，利用组培快速繁殖技术，加速良种及良砧无性苗的繁育，具有很高的商业价值。然而，核桃细胞中含有丰富的酚类物质，在组织培养过程中，酚类物质从外植体切口向外溢出，氧化产生棕褐色的醌类物质，使外植体组织变成褐色；醌类物质与外植体组织中的蛋白质发生聚合，引起酶系统的失活，从而导致外植体组织代谢活动紊乱，生长和分化停滞，最终衰老死亡；并且醌类物质扩散到培养基中也会进一步地促进外植体衰老死亡。因此，防止核桃组培外植体褐化是保证核桃组培成功关键所在，而核桃外植体的褐化程度与核桃选取的树龄，剪取枝段的部分、月份，培养基的成分，抗氧化剂的种类都有关系，所以亟待设计一种解决核桃外植体褐化问题的培养基及培养方法。
技术实现思路
基于现有技术的不足之处，本专利技术提供一种降低核桃外植体褐变率的培养基及培养方法。本专利技术为了实现上述目的所采取的技术方案是：一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：包括蛭石和培养液。进一步地，所述蛭石与所述培养液的配比为：每10g蛭石中混合添加有15-25mL培养液。进一步地，所述培养液包括以下成分：硝酸铵1.4-1.5g/L；硝酸钙1.8-2.0g/L；硝酸锌0.015-0.02g/L；硫酸钾1.5-1.7g/L；硫酸镁0.6-0.8g/L；硫酸锰0.03-0.04g/L；硫酸铜0.002-0.003g/L；氯化钙0.15-0.2g/L；磷酸二氢钾0.2-0.5g/L；硼酸0.004-0.007g/L；钼酸钠0.003-0.004g/L；乙二胺四乙酸二钠0.05-0.06g/L；硫酸亚铁0.03-0.05g/L；盐酸硫胺素0.001-0.003g/L；烟酸0.001-0.002g/L；甘氨酸0.001-0.003g/L；肌醇0.1-0.2g/L；蔗糖25-35g/L；6-苄氨基腺嘌呤0.0005-0.0015g/L；吲哚丁酸0.00001-0.00003g/L，pH5.5-6.0。进一步地，所述培养液成分为：硝酸铵1.416g/L，硝酸钙1.968g/L，硝酸锌0.017g/L，硫酸钾1.5592g/L，硫酸镁0.74g/L，硫酸锰0.0335g/L，硫酸铜0.0025g/L，氯化钙0.18625g/L，磷酸二氢钾0.33125g/L，硼酸0.006g/L，钼酸钠0.0039g/L，乙二胺四乙酸二钠0.05675g/L，硫酸亚铁0.04225g/L，盐酸硫胺素0.0025g/L，烟酸0.00125g/L，甘氨酸0.0025g/L，肌醇0.125g/L，蔗糖30g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.001g/L，吲哚丁酸0.00002g/L，pH5.5-6.0。一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)外植体培养前处理：采集核桃未木质化新梢，选取带有饱满芽的枝段，剪至3-4厘米长，进行清洗和消毒；(2)初代培养：将蛭石倒入培养瓶中，加入培养液，盖上瓶盖，灭菌，即配制成初代培养基；将消毒后的外植体接于初代培养基中，培养12-14天；(3)继代培养：将初代培养得到的外植体转接到所述培养液的琼脂培养基中进行继代培养。进一步地，所述步骤(1)中清洗和消毒的具体方法为：使用1％洗洁精清洗浸泡5min，流水清洗20min；后用75％酒精消毒30s，流水清洗5-8次；再用0.1％升汞浸泡6-8min，无菌水清洗5-8次。进一步地，所述培养液的琼脂培养基为每升所述培养液中添加6.5-7.5g琼脂制得。有益效果：本专利技术提供了一种降低核桃外植体褐变率的培养基，培养基以蛭石为固态基质，具有良好的吸附性和透气性，可将外植体伤口处的酚类物质选择性地吸附、疏散，防止酚类物质在外植体切口积累；培养基将营养丰富、流动性强的培养液与蛭石以一定比例混合，在保证核桃外植体生长分化所需营养、水分的同时，进一步减轻外植体褐化的程度。此外，本专利技术提供了一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，通过以蛭石为固态基质的培养基进行初代培养，降低切口褐化程度，保证外植体切口受损细胞的快速愈合；初代培养后利用培养液的琼脂培养基进行继代培养，进一步为外植体提供充足的水分和营养物质，保证外植体的快速生长分化。综上所述，本专利技术培养基及培养方法防止核桃外植体褐化的效果显著，且适用于多种核桃品种，应用范围广，利于提高组培繁殖的成活率，加速良种及良砧无性苗的繁育。附图说明图1所示为本专利技术实施例1实验组培养的清香核桃外植体；图2所示为本专利技术实施例1对照组培养的清香核桃外植体；图3所示为本专利技术实施例1实验组与对照组褐变率统计图；图4所示为本专利技术实施例1继代培养中的实验组外植体；图5所示为本专利技术实施例1再次继代培养中的实验组外植体；图6所示为本专利技术实施例2中不同品种核桃外植体的褐变率统计，其中，A.清香；B.赞美；C.强特勒；D.清脆；E.辽宁1号；F.辽宁7号；G.辽宁10号；H.寒丰；I.珍珠香；J.HT1-QX；K.HT2-ZM；L.HT6-L7；M.易县西陵。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术进行进一步详述：实施例1一种降低核桃外植体褐变率的培养基，包括蛭石和培养液，每10g蛭石中混合添加有20mL培养液；培养液包括以下成分：硝酸铵1.416g/L，硝酸钙1.968g/L，硝酸锌0.017g/L，硫酸钾1.5592g/L，硫酸镁0.74g/L，硫酸锰0.0335g/L，硫酸铜0.0025g/L，氯化钙0.18625g/L，磷酸二氢钾0.33125g/L，硼酸0.006g/L，钼酸钠0.0039g/L，乙二胺四乙酸二钠0.05675g/L，硫酸亚铁0.04225g/L，盐酸硫胺素0.0025g/L，烟酸0.00125g/L，甘氨酸0.0025g/L，肌醇0.125g/L，蔗糖30g/L，6-苄氨基腺嘌呤0.001g/L，吲哚丁酸0.00002g/L，pH6.0。常规的核桃外植体多数采用琼脂培养基进行培养，核桃外植体切口附近的细胞受到损伤，细胞内的酚类物质会在伤口处积累，氧化成醌类物质，进而逐步扩散，抑制外植体的生长和再生芽的分化；而本专利技术培养基采用蛭石作为培养基的固态基质，蛭石具有良好的吸附性和透气性，与流动性强的培养液混合后，可将外植体伤口处的酚类物质选择性地吸附、疏散，防止其在伤口处积累形成恶性循环。此外，培养液中无机盐、蔗糖、激素浓度以及培养液的pH均是综合了外植体正常生长分化需要和对外植体褐化的影响得到的，在保证提供充足的营养物质的同时，进一步减轻外植体褐化的程度。一种降低核桃外植体褐变率的培养方法，包括以下步骤：(1)外植体培养前处理以7年生生长结果正常的清香核桃植株为实验材料，于4月初采集核桃未木质化新梢，剪至3-4厘米长；使用1％洗洁精清洗浸泡5min，流水清洗20min；后用75％酒精消毒30s，流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：包括蛭石和培养液。

【技术特征摘要】
1.一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：包括蛭石和培养液。2.根据权利要求1所述的一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：所述蛭石与所述培养液的配比为：每10g蛭石中混合添加有15-25mL培养液。3.根据权利要求2所述的一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：所述培养液包括以下成分：硝酸铵1.4-1.5g/L；硝酸钙1.8-2.0g/L；硝酸锌0.015-0.02g/L；硫酸钾1.5-1.7g/L；硫酸镁0.6-0.8g/L；硫酸锰0.03-0.04g/L；硫酸铜0.002-0.003g/L；氯化钙0.15-0.2g/L；磷酸二氢钾0.2-0.5g/L；硼酸0.004-0.007g/L；钼酸钠0.003-0.004g/L；乙二胺四乙酸二钠0.05-0.06g/L；硫酸亚铁0.03-0.05g/L；盐酸硫胺素0.001-0.003g/L；烟酸0.001-0.002g/L；甘氨酸0.001-0.003g/L；肌醇0.1-0.2g/L；蔗糖25-35g/L；6-苄氨基腺嘌呤0.0005-0.0015g/L；吲哚丁酸0.00001-0.00003g/L，pH5.5-6.0。4.根据权利要求3所述的一种降低核桃外植体褐变率的培养基，其特征在于：所述培养液成分为：硝酸铵1.416g/L，硝酸钙1.968g/L，硝酸锌0.017g/L，硫酸钾1.5592g/L，硫酸镁0.74g/L，硫酸锰0.0335g/L，硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵书岗，张志华，王红霞，赵悦平，高仪，王双，牛佳敏，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13