一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法技术

本发明专利技术提供了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，疫苗半成品毒液经澄清过滤、浓缩纯化、灭活、稀释、与双相佐剂混合乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗，并评价疫苗质量。与现有生产工艺相比，本发明专利技术制备的疫苗副反应小、抗原含量高、疫苗质量稳定、生产成本低、疫苗免疫效果评价快速有效。

The production method of porcine circovirus type 2 inactivated vaccine

The present invention provides a method for the production of porcine circovirus type 2 inactivated vaccine, vaccine semi-finished products after clarification filtration, concentration and purification of venom, inactivation, dilution, and dual phase hybrid emulsion adjuvant, preparation of porcine circovirus type 2 inactivated vaccine, and evaluate the quality of the vaccine. Compared with the existing production process, the vaccine prepared by the invention has the advantages of small side effect, high antigen content, stable vaccine quality, low production cost, and fast and effective evaluation of the vaccine immune effect.

【技术实现步骤摘要】
一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法
本专利技术涉及一种疫苗的生产方法，尤其是一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，属于生物

技术介绍
猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，自1991年加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，在我国猪群中流行十分严重，临床上常与猪高致病性繁殖与呼吸综合征、猪口蹄疫以及猪细小病毒病等混合感染、继发感染，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。疫苗免疫接种是防控猪圆环病毒病（PCVD）的有效手段，目前商品化的猪圆环病毒疫苗均为灭活疫苗，受生产方式限制，还普遍存在着抗原含量偏低、副反应机率大和效力评价方法单一等问题，影响了疫苗应用效果。⑴抗原含量偏低：按照生产标准PCV2疫苗半成品毒液毒价趋于106.0～107.0TCID50/ml，毒液处理及灭活过程中抗原损失量大。⑵疫苗效力评价方法单一：目前PCV2灭活疫苗效力检验是采用仔猪或小鼠免疫攻毒法，仔猪攻毒实验尤其存在筛选阴性实验猪的困难，动物攻毒实验检测周期长（小鼠52天、仔猪45天），PCV2攻毒模型建立困难，检验结果批间差异大。⑶疫苗副反应机率大：由于灭活病毒液含有大量异物蛋白及灭活剂，因此仔猪和母猪免疫过程中极易出现副反应。因此有必要开发一种新型的猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，以解决以上问题，提升疫苗质量。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，经PCV2病毒澄清过滤、浓缩纯化、灭活、乳化及成品苗评价，生产出抗原含量高、副反应小、质量稳定的猪圆环病毒2型灭活疫苗。一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，包括以下步骤：⑴提供猪圆环病毒2型疫苗半成品病毒液，所述半成品病毒液为猪圆环病毒2型细胞培养液，病毒含量≥107.0TCID50/ml；⑵所述半成品病毒液经微滤中空纤维膜澄清过滤，收集滤过液，残余液加入1/3~1倍体积量的pH7.2的PBS液，再次澄清过滤，收集洗液，混合所述滤过液和所述洗液，得到澄清过滤后的病毒液；⑶将所述澄清过滤后的病毒液经100KD~1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，收集浓缩液，补加pH7.2的PBS液进行洗涤，再次浓缩，最终获得浓缩液为原病毒液体积的1/10~1/5；得到纯化浓缩病毒液；⑷按照所述纯化浓缩病毒液的体积的0.05%~0.2%加入灭活剂，搅拌灭活24~36小时，灭活过程中控制灭活体系pH稳定在7.0~7.4之间；⑸测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，添加pH7.2PBS液进行稀释，使Cap蛋白含量定量于25~80μg/ml；⑹抗原液与双相佐剂混合乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗；⑺疫苗效力评价：猪圆环病毒2型灭活疫苗与破乳剂按照体积比1:5~1:10震荡混合，静置至油相、水相分离，高速离心，弃去上层液体，室温干燥后加入去离子水溶解析出蛋白，制备成疫苗蛋白液，测定疫苗蛋白液中Cap蛋白含量以快速评价疫苗质量。上述技术方案中，步骤⑵中所述微滤中空纤维膜的孔径为0.45μm或0.65μm。上述技术方案中，步骤⑶中所述超滤中空纤维膜的孔径为100KD或300KD。上述技术方案中，步骤⑷中所述灭活剂为β-丙内酯、甲醛或戊二醛。上述技术方案中，步骤⑷中通过实时监测所述灭活体系的pH值，并根据pH值而实时加入NaOH溶液来控制所述灭活体系的pH稳定在7.0~7.4。上述技术方案中，步骤⑸和步骤⑺中使用SDS-PAGE结合分光光度计定量法测定所述Cap蛋白含量。上述技术方案中，步骤⑸中所述Cap蛋白含量定量于50~80μg/ml。上述技术方案中，步骤⑺中所述破乳剂为丙酮、异丙醇或正丁醇。与现有生产工艺相比，本专利技术猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法具有以下有益效果：⑴疫苗副反应小：病毒液中的细胞碎片和异物蛋白是造成猪体副反应的主要原因，本专利技术采用澄清过滤去除细胞碎片和大蛋白，使用超滤浓缩去除小分子异物蛋白，经检测纯化后病毒液异物蛋白去除率达75%，极大的降低了疫苗副反应几率。⑵抗原含量高：传统生产工艺生产猪圆环病毒2型灭活疫苗，其有效免疫蛋白Cap蛋白含量≤25μg/头份，且批间差异大。本专利技术首先通过浓缩纯化工艺可提高抗原含量，获得高浓度Cap蛋白含量的抗原液，是传统工艺抗原含量的3倍；其次灭活过程中控制灭活体系pH值，能够有效减少由于低pH值造成的蛋白析出，降低Cap蛋白损失。⑶疫苗质量稳定：传统生产工艺由于半成品毒液效价偏低、灭活过程损失的影响，造成生产的灭活疫苗的有效免疫抗原含量批间差异大。本专利技术通过控制乳化前抗原液Cap蛋白含量，确保成品疫苗中有效免疫蛋白含量，提高疫苗批间质量稳定性。⑷生产成本低：本专利技术中病毒灭活剂使用量降低为传统工艺的20%，灭活过程中控制pH值减少有效蛋白析出，两项技术结合有效降低疫苗生产成本。⑸疫苗免疫效果评价快速有效：与传统的仔猪或小鼠免疫攻毒法比较，本专利技术疫苗破乳后测定Cap蛋白含量以评价疫苗质量的检测方法，检验周期是4天，极大缩短疫苗评价时间。通过大量Cap蛋白含量与免疫效果的实验数据分析，疫苗中Cap蛋白含量的多少与疫苗免疫保护效果呈线性相关关系，因此本专利技术中的疫苗评价方法具有高效、快速和稳定的优点。附图说明图1SDS-PAGE图(标准品和各测试样品蛋白电泳图)。1～6泳道分别是20μgBSA、16μgBSA、12μgBSA、8μgBSA、4μgBSA、2μgBSA；7～9泳道是灭活前样品、控pH灭活后样品、未控pH灭活后样品；10泳道为Marker(M)，其分子量标尺100、75、50、40、30、25KD。图2疫苗免疫后抗体水平图(不同Cap蛋白含量的疫苗免疫猪体后不同时间抗体水平曲线图)。具体实施方式实施例1：半成品毒液澄清过滤、浓缩纯化猪圆环病毒2型ZJ/C株由瑞普（保定）生物药业有限公司生产部提供，2012年11月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO:V201251。A.病毒液的准备已长满单层的PK-15细胞经消化分散接入细胞培养瓶中，使每个10L瓶内细胞数量为2~3×108个。同时按照培养液体积的0.5%加猪圆环病毒2型种毒到细胞悬液里。混匀后，37℃转动培养，10r/h。接毒后培养72小时收获，得到猪圆环病毒2型疫苗半成品毒液。使用间接免疫荧光检测法（IFA方法）测定病毒含量，病毒含量为≥107.0TCID50/ml。B.澄清过滤⑴组装系统，安装入0.45μm微滤中空纤维膜。0.5MNaOH溶液浸泡处理1h，对系统进行灭菌处理。用灭菌水对系统进行循环冲洗，洗去残余的溶液，直至pH为7.0左右。将0.1MpH7.2PBS溶液加入处理系统，循环，弃尽。⑵过滤病毒：将50000ml病毒液通过澄清过滤系统循环处理，收集40000ml滤过液；残余液中加入5000mlpH7.2PBS液，再次澄清过滤，得到5000ml洗液1；重复洗涤过滤1次，得到6500ml洗液2和7500ml残渣。收集混合滤过液、洗液1和洗液2获得51500ml澄清后毒液。⑶使用IFA方法测定澄清过程中的原液、滤过液、洗液1、洗液2、澄清后毒液和残渣的病毒含量，以监测澄清过程中病毒的损失率。使用BCA蛋白含量检测试剂盒测定所有样品内水溶性蛋白含量。C.浓缩纯化⑴组装系统，安装入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴提供猪圆环病毒2型疫苗半成品病毒液，所述半成品病毒液为猪圆环病毒2型细胞培养液，病毒含量≥10

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：⑴提供猪圆环病毒2型疫苗半成品病毒液，所述半成品病毒液为猪圆环病毒2型细胞培养液，病毒含量≥107.0TCID50/ml；⑵所述半成品病毒液经微滤中空纤维膜澄清过滤，收集滤过液，残余液加入1/3~1倍体积量的pH7.2的PBS液，再次澄清过滤，收集洗液，混合所述滤过液和所述洗液，得到澄清过滤后的病毒液；⑶将所述澄清过滤后的病毒液经100KD~1000KD超滤中空纤维膜浓缩纯化，收集浓缩液，补加pH7.2的PBS液进行洗涤，再次浓缩，最终获得浓缩液为原病毒液体积的1/10~1/5；得到纯化浓缩病毒液；⑷按照所述纯化浓缩病毒液的体积的0.05%~0.2%加入灭活剂，搅拌灭活24~36小时，灭活过程中控制灭活体系pH稳定在7.0~7.4之间；⑸测定灭活抗原液中Cap蛋白含量，添加pH7.2PBS液进行稀释，使Cap蛋白含量定量于25~80μg/ml；⑹抗原液与双相佐剂混合乳化，制备猪圆环病毒2型灭活疫苗；⑺疫苗效力评价：猪圆环病毒2型灭活疫苗与破乳剂按照体积比1:5...

【专利技术属性】
技术研发人员：马明，赵玉龙，吴雅清，焦玉兰，朱秀同，石勇，赵丽霞，
申请(专利权)人：瑞普保定生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13