一种胰岛靶向蛋白及其真核表达方法技术

本发明专利技术提供一种胰岛靶向蛋白及其真核表达方法，该方法包括以下步骤：(1)构建含有蛋白编码基因IGRP206‑214‑dtSCT的质粒；(2)将所述质粒重组到巴斯德酵母的染色体中；(3)通过甲醇发酵诱导获得目的蛋白。通过真核表达系统制备可溶性IGRP206‑214MHC复合物，较原先制备的原核表达的蛋白存在糖基化修饰，更加接近体内的蛋白晶体结构，增加特异性CTL对蛋白的识别率，以及TCR与MHC分子结合的稳定性，从而增加偶联到蛋白上的毒性被内吞的量，增加重组蛋白的效力，且糖基化修饰后重组蛋白在外环境中更加稳定，保存周期增加。

An islet targeting protein and its eukaryotic expression method

The present invention provides a method to target islet and eukaryotic expression protein, the method comprises the following steps: (1) plasmid containing the gene encoding IGRP206 protein 214 dtSCT; (2) the recombinant plasmid into the chromosome of yeast in Pasteur; (3) induced by methanol to obtain protein fermentation. Preparation of soluble IGRP206 214MHC complexes by eukaryotic expression, prokaryotic expression system was prepared by protein glycosylation, protein crystal structure is more close to the body, increase the recognition of protein specific CTL rate, and the stability of TCR and MHC molecules, thereby increasing the coupling to the protein toxicity was endocytosis, increase the potency of the recombinant protein, and glycosylated recombinant protein is more stable in the external environment, the preservation period increased.

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛靶向蛋白及其真核表达方法
本专利技术属于生物蛋白制备领域，更具体地，涉及一种胰岛靶向蛋白的真核表达方法，以及由该方法得到的胰岛靶向蛋白。
技术介绍
NOD(no-obesediabetes)鼠是研究Ⅰ型糖尿病的动物模型，在13周龄体内的胰岛β细胞表面出现出现IGRP206-214抗原肽，通过MHC包裹递呈给细胞毒性T细胞(CTL)，CTL识别后通过分泌颗粒酶、穿孔素等杀伤胰岛β细胞，造成胰岛素分泌减少，血糖升高。课题组前期已通过原核表达系统制备胰岛靶向蛋白可溶性IGRP206-214-dtSCT复合物，并制备成四聚体、偶联毒素-皂草素后被特异性CTL识别，细胞内吞毒性后坏死，达到延缓糖尿病发病的作用。然而，原核表达系统由于不具备糖基化功能，不能真实模拟该蛋白的特性。目前，尚未有利用真核表达系统制备可溶性IGRP206-214MHC复合物的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胰岛靶向蛋白的真核表达方法，以及由该方法得到的胰岛靶向蛋白。本专利技术的第一方面提供一种胰岛靶向蛋白的真核表达方法，包括以下步骤：(1)构建含有蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT的质粒；(2)将所述质粒重组到巴斯德酵母的染色体中；(3)通过甲醇发酵诱导获得目的蛋白。优选地，所述蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT包括上游的Linker1编码序列、IGRP206-214基因编码序列和下游的Linker2编码序列，其中，所述Linker1的序列为GCGAS(G4S)2，且编码序列的第二位密码子为TGC，所述Linker2的序列为(G4S)4。其中，IGRP206-214的序列为VYLKYNVFC。优选地，所述含有蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT的质粒包括载体、蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT、5’端信号肽α-因子、3’端HRV3C蛋白酶切消化位点(编码基因为5’-tggaccttgaaacaaaacttccaa-3’，SEQIDNO：3)、Avi-Tag(生物素化位点编码基因为5’-ttcgtgccattcgattttctgagcctcgaagatgtcgttcagaccgccacc-3’，SEQIDNO：4)、6×his-tag以及双酶切位点。所述双酶切位点优选为XhoⅠ酶切位点(ctcgag)和NdeⅠ酶切位点(catatg)。优选地，所述载体为pPICZαA。优选地，所述蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT具有SEQIDNO：1所示的碱基序列。优选地，所述含有蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT的质粒具有SEQIDNO：2所示的碱基序列。上述修饰，使导入巴斯德酵母GS115中表达过程能酶切去除N和C段杂氨基酸。并且符合表达系统的要求。优选地，所述质粒进行单酶切后重组到巴斯德酵母的染色体中，所述单酶切的位点位于AOX1上。线性化，是为了通过质粒和毕赤酵母染色体共有的5’AOX1进行同源重组，将重组基因插入到染色体内，使重组基因在酵母内稳定的复制转录。根据本专利技术，单酶切位点为PmeⅠ酶切位点。优选地，步骤(3)中，诱导的过程中，加入D-biotin作为酵母蛋白酶的竞争性底物，并且，每隔8-15小时，加入总体积2-4％的甲醇；所述诱导在15-22℃下进行。诱导的培养基上清体积浓缩后直接进行Ni离子亲和纯化，相较于原核表达系统省却了蛋白复性。本专利技术的第二方面提供由上述的真核表达方法得到的胰岛靶向蛋白，所述胰岛靶向蛋白的分子量优选为52-52.5KD，所述胰岛靶向蛋白的糖基化位点为N229、N319和N399。即重组蛋白氨基酸序列的第229，319，399的天冬氨酸。本专利技术的胰岛靶向蛋白相较于未糖基化的相同编码基因转录翻译的产物分子量，重组蛋白分子量由51-51.5kDa上升到52-52.5kDa；获得的重组蛋白在不进行复性的前提下，western-blot和dot-blot结果均显示构象的正确性。通过真核表达系统制备可溶性IGRP206-214MHC复合物，较原先制备的原核表达的蛋白存在糖基化修饰，更加接近体内的蛋白晶体结构，增加特异性CTL对蛋白的识别率，以及TCR与MHC分子结合的稳定性，从而增加偶联到蛋白上的毒性被内吞的量，增加重组蛋白的效力，且糖基化修饰后重组蛋白在外环境中更加稳定，保存周期增加。附图说明图1为验证真核表达质粒pPICZαA的琼脂糖凝胶电泳图。图2示出了本专利技术的质粒设计方案。图3A示出了PE-IGRP206-214-dtSCT流式标记的非特异染色检验结果的流式结果典型图，a.NOD雌鼠外周血，b.Balb/c雌鼠外周血；图3B为流式结果柱状分析图。图4A示出了重组蛋白的Dot-blot结果；图4B示出了重组蛋白的Western-blot结果。图5为重组蛋白的飞行质谱图，其中，A为eIGRP206-214-dtSCT蛋白，B为经PNGase处理的eIGRP206-214-dtSCT蛋白。图6A为eIGRP206-214-dtSCT体外刺激特异性CTL的流式结果典型图；图6B为流式结果柱状分析图。图7A为eIGRP206-214-dtSCT-Tetramer体外刺激特异性CTL的流式结果典型图；图7B为流式结果柱状分析图。图8A为偶联毒素蛋白体外刺激特异性CTL的流式结果典型图；图8B为流式结果柱状分析图。具体实施方式下面将更详细地描述本专利技术的优选实施方式。其中，所用的各种试剂均可通过商购获得，具体操作方法参照商购试剂随附操作手册进行。本专利技术涉及的术语缩写、英文全称和中文全称如表1所示。表1一、IGRP206-214-dtSCT真核表达系统的构建及蛋白制备扩增出IGRP206-214的全长编码基因，在末端加入可生物素化位点和6×his标签，以及首末端加入酶切位点插入真核表达质粒中，导入巴斯德酵母中构建蛋白的真核表达体系，并利用甲醇培养进行诱导目的蛋白的表达。利用Oligo7设计PCR反应过程中目的基因的上下游引物，并预估得到退火温度，得到P1F、P1R、P2F、P2R四种引物序列，送生工定制引物。1、PCR扩增IGRP206-214-dtSCT基因片段1)吸取单克隆菌株培养液1mL，用质粒小提试剂盒提取pet22b-IGRP206-214-dtSCT质粒，溶于100μL纯水中。2)利用上下游引物P1F、P1R进行PCR扩增，以上一步的质粒为反应模板。PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10sec，59.6℃退火5sec，72℃延伸78sec，反应35个循环；再次72℃延伸5min；16℃无限反应。3)PCR产物跑琼脂糖电泳鉴定长度准确性，并于紫外灯下无菌(防止环境中杂基因干扰)切胶回收，利用胶回收试剂盒得到IGRP206-214-dtSCT编码片段(W1)，溶于100μL超纯水中。PCR反应体系加入量5×primerSTARbuffer(Mg2+Plus)10μLdNTPMixture(2.5mMeach)4μLP1F/P1R(10mM)各1μL(实验前预混)pet22b-IGRP206-214-dtSCT质粒＜200ngPrimerStarHSDNAPolymerase(2.5U/mL)0.5μL灭菌蒸馏水至50μL2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛靶向蛋白的真核表达方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)构建含有蛋白编码基因IGRP206‑214‑dtSCT的质粒；(2)将所述质粒重组到巴斯德酵母的染色体中；(3)通过甲醇发酵诱导获得目的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种胰岛靶向蛋白的真核表达方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)构建含有蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT的质粒；(2)将所述质粒重组到巴斯德酵母的染色体中；(3)通过甲醇发酵诱导获得目的蛋白。2.根据权利要求1所述的胰岛靶向蛋白的真核表达方法，其中，所述蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT自5’-3’依次包括IGRP206-214基因编码序列、Linker1编码序列、MHC的重链α链编码序列、Linker2编码序列和MHC的轻链β2微球蛋白编码序列，其中，所述Linker1的序列为GCGAS(G4S)2，且编码序列的第二位密码子为TGC，所述Linker2的序列为(G4S)4。3.根据权利要求1所述的胰岛靶向蛋白的真核表达方法，其中，所述含有蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT的质粒包括载体、蛋白编码基因IGRP206-214-dtSCT、5’端信号肽α-因子、3’端HRV3C蛋白酶切消化位点、Avi-Tag、6×his-tag以及双酶切位点。4.根据权利要求3所述的胰岛靶向蛋白的真核...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇航，李凯，
申请(专利权)人：李凯，
类型：发明
国别省市：江苏,32