表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及表达Tim‑3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途。本发明专利技术所述的NK细胞具有耐受表型与低细胞杀伤毒性，经试验证明所述的表达Tim‑3的外周血NK细胞在正常妊娠外周血的高表达，而自然流产患者这种细胞数量下降、功能紊乱；拮抗NK细胞的Tim‑3导致妊娠失败，过继转输该NK细胞亚群可挽救免疫性自然流产模型以及NK敲除所致的妊娠失败；所述的表达Tim‑3的外周血NK细胞可用于制备自然流产生物标记物，进一步作为临床不明原因自然流产的新型预测与防治靶点。

Application of peripheral blood NK cells expressing Tim-3 in the preparation of biomarkers for spontaneous abortion

The invention belongs to the field of biotechnology and relates to the expression of Tim NK cells in peripheral blood of 3 preparation uses natural abortion biomarkers in system. The NK cells with low cell toxicity and tolerance phenotype, the expression of Tim test proves that the NK cells in the peripheral blood of 3 normal pregnancy in peripheral blood of high expression, and the number of cells in patients with spontaneous abortion decreased and dysfunction of NK cells against Tim; 3 leads to pregnancy failure, the adoptive transfer of NK cell subsets may save the immune model of spontaneous abortion and NK knockout failure caused by pregnancy; the expression of Tim said 3 of the peripheral blood NK cells can be used for the preparation of natural abortion biomarkers, further as a new target for clinical prediction and prevention of unexplained spontaneous abortion.

【技术实现步骤摘要】
表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途
本专利技术属于生物
涉及预测与防治自然流产的生物标记物，具体涉及表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途。该自然流产的生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测与防治靶点。
技术介绍
现有技术公开了有关妊娠结局的预测方法主要是根据孕妇的外周血HCG-β与孕酮水平，但实践中大量的证据表明孕妇外周血P水平与妊娠结局关系并不完全一致；尽管HCG-β能比较真实的反应孕妇的妊娠预后，但越来越多的临床资料表明：一旦孕妇外周血HCG下降(除了HCG-β生理性下降)，胚胎已无法挽救；另外，部分孕妇尽管持续分泌大量的HCG-β与P，但胚胎仍停止发育(或是空胚囊)；显然HCG-β与P作为检测妊娠结局的指标存在诸多的缺陷，临床实践迫切需要一个反映早孕期妊娠状态的早期预测与防治的生物指标。研究公开了，胚胎表达父系抗原，因而可视为一种半同种移植物，作为这种半同种移植物的胚胎能够在母体内存活直至分娩实际是反应了母体对胚胎的免疫耐受。一旦这种母-胎免疫耐受被打破，将会导致妊娠失败或自然流产与妊娠并发症。自然流产是严重危害人类生殖健康的常见疾患之一，其发生率呈现逐年上升的趋势。据统计资料表明，目前，自然流产发生率高达15～40％，即便是在辅助生育技术飞速发展的今天，仍不能克服因母-胎免疫调节紊乱造成的妊娠失败，遗憾的是临床实践中仍缺乏对之有效的早期诊断与防治策略。自然流产的发生多归因于遗传、感染、内分泌、生殖道畸形等等，但临床仍有50％以上的流产尤其是反复自然流产病因不明，其中，母-胎免疫调节失衡被认为是重要原因之一；有研究显示，免疫细胞是母-胎免疫耐受的执行者与效应者，其中NK细胞在母-胎耐受中发挥至关重要的调节作用；本申请的前期研究发现，蜕膜NK细胞对母-胎耐受的建立和维持至关重要，妊娠期蜕膜NK细胞通过细胞表面分子与细胞内各种因子的作用，维持母-胎耐受与正常妊娠的进行，然而由于妊娠期蜕膜组织不易获取，用于临床诊断与防治靶点几无可能。因此，临床实践中迫切需要一个简单可靠的方法对早期自然流产的免疫学状态进行客观的评估，并能对之进行干预以达到防治自然流产挽救妊娠胚胎的目的。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种预测与防治自然流产的生物标记物，尤其是表达Tim-3的外周血NK细胞在用于制备自然流产生物标记物中的用途。该自然流产的生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测与防治靶点。
技术实现思路
本专利技术的目地是克服现有技术存在的缺陷，提供一种预测与防治自然流产的生物标记物，具体涉及表达Tim-3的外周血NK细胞在用于制备自然流产生物标记物中的用途。该自然流产的生物标记物可用于作为早期妊娠失败的预测与防治靶点。本专利技术中，进行了不同妊娠状态外周血Tim-3+NK细胞百分率比较实验与差异分析，分析Tim-3在不同妊娠状态外周血NK细胞的表达特征及其调节情况；结果显示，Tim-3在NK细胞表达水平在不同孕期有明显差异，妊娠早期外周血NK细胞Tim-3表达明显上调，妊娠中期降至未孕期水平；妊娠早期，妊娠相关激素(主要是孕酮)与Th2型细胞因子(IL-4)参与外周NK细胞的Tim-3表达上调；本专利技术中，进行了Galectin-9/Tim-3信号介导早孕外周NK细胞免疫耐受试验，结果显示：与Tim3-NK细胞相比，Tim-3+NK细胞产生较高水平的Th2型细胞因子和较低水平的Th1型细胞因子，并呈现出较弱的杀伤活性，这些表型特征将更有利于维持妊娠外周免疫的耐受状态；，NK细胞上的Tim-3受体与Galectin-9相互作用，通过活化Akt、JNK信号通路，促进转录因子Id-2、Blimp1、Gata-3的表达，进而诱导外周NK细胞向免疫耐受表型分化；Tim-3/Gal-9信号参与NK细胞优势产生Th2型细胞因子；本专利技术中，进行了早孕外周NK细胞Galectin-9/Tim-3信号异常致NK功能障碍与妊娠失败的试验，结果表明，外周NK细胞Tim-3表达的降低及外周Gal-9产生水平的下调破坏外周NK细胞通过分泌细胞因子和维持较低的杀伤活性而发挥的免疫耐受作用，进而导致自然流产；进一步，本专利技术进行了干扰Gal-9/Tim-3信号通路对妊娠结局的影响试验以及过继转输Tim-3+NK细胞挽救妊娠失败实验，结果显示，Tim-3在正常妊娠过程中通过调节外周NK细胞的功能起保护作用，如果Tim-3所介导的信号通路被破坏，会影响外周NK细胞的功能甚至分化发育，从而影响妊娠的正常进行和胚胎的发育，尤其Galectin-9/Tim-3信号通路异常会引起早孕外周血NK细胞功能紊乱致不良妊娠结局；经过IL-4和孕酮刺激的Tim-3+NK细胞有效缓解流产模型高胚胎吸收率；过继转输Tim-3+NK细胞降低NK细胞缺陷小鼠的胚胎吸收率，过继转输Tim-3-NK细胞不影响妊娠结局。本专利技术经试验证明了一种耐受性NK亚群在正常妊娠外周血的高表达，而自然流产患者这种细胞数量下降、功能紊乱；拮抗NK细胞的Tim-3导致妊娠失败，过继转输该NK细胞亚群可挽救免疫性自然流产模型以及NK敲除所致的妊娠失败；所述的表达Tim-3的外周血NK细胞可用于制备自然流产生物标记物，进一步作为临床不明原因自然流产的新型预测与防治靶点。本项专利技术的优点在于：提供了表达Tim-3的外周血NK细胞可用于制备自然流产生物标记物，进一步作为临床不明原因自然流产的新型预测与防治靶点；所述的Tim-3+NK细胞在妇女外周血存在，其表型与功能在早孕外周与蜕膜局部高度一致，只需抽取少许外周血，通过流式细胞分析即可监测孕妇的子宫局部与全身的免疫耐受状态；不仅如此，针对这群细胞，通过体外刺激(如IL-4、P)后过继转输该亚群细胞可用于直接防治反复自然流产患者的再次妊娠失败。附图说明图1：显示人早孕外周血不同免疫细胞亚群Tim-3的表达情况以及Tim-3+NK细胞在不同孕期的比例，其中Tim-3+NK细胞在早孕期比例明显高于非孕与中孕期。图2，显示IL-4/STAT6信号与妊娠相关的孕激素上调外周血Tim3+NK细胞比例，其中，Th2型细胞因子IL-4通过活化STAT6信号上调Tim-3表达，STAT6抑制剂与Th1型细胞因子抑制IL-4的这种调节作用，经典的保胎剂孕酮亦促进pNK细胞表达Tim-3。图3，显示人早孕外周血Tim-3+NK细胞呈现免疫耐受表型，其中，芯片分析结果显示Tim-3+NK细胞和Tim-3-NK细胞是有差异基因表达的两群NK细胞亚群，Tim-3+NK细胞中865个基因上调表达，100个基因下调表达，并且上调表达的基因多与Th2型免疫应答及免疫耐受有关；FCM分析人早孕外周血Tim-3+与Tim-3-的NK细胞，发现与Tim-3-NK细胞相比，Tim-3+NK细胞产生更高水平IL-4、IL-10与TGF-β，更低水平的TNF-α与Perforin；其对滋养细胞的杀伤活性亦明显下降。图4：Galectin-9/Tim-3信号通过活化JNK与AKT信号调控外周NK细胞呈现耐受表型，其中显示，Tim-3的天然配体Gal-9刺激pNK细胞，qPCR与westernblot显示Gal-9刺激后活化与NK细胞发育分化本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达Tim‑3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途；所述的NK细胞具有免疫耐受表型和低细胞杀伤活性。

【技术特征摘要】
1.表达Tim-3的外周血NK细胞在制备自然流产生物标记物中的用途；所述的NK细胞具有免疫耐受表型和低细胞杀伤活性。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞优势表达IL-4、IL-10与TGF-β，低表达TNF-α；低细胞杀伤活性与Perforin表达率。3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞在自然流产患者与小鼠模型中的细胞数量明显低于正常妊娠。4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的NK细胞在自然流产患者Tim-3+NK细胞TGF-β与IL-10启动子和增强子的染色质接近性降低...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜美蓉，李彦虹，张迪，常兴，李大金，
申请(专利权)人：复旦大学附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：上海,31