山茶皂苷A（Camellioside A）的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种山茶皂苷A(Camellioside A)的应用，属功效性化妆品技术领域。本发明专利技术的山茶皂苷A(Camellioside A)选用中国科学院昆明植物研究所植物园内的山茶(Camellia japonica L.)用常规方法得到。该山茶皂苷A(Camellioside A)在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。本发明专利技术的有益效果在于：山茶皂苷A(Camellioside A)是生态化合物，成本低，具有抑制黑素合成和提高对UVB照射细胞的抗氧化能力，能够在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。

Application of Camellia Saponin A (Camellioside A)

The invention relates to a camellia saponin A (Camellioside A) application, which belongs to the technical field of functional cosmetics. The invention of the camellia saponin A (Camellioside A) the Kunming Botanical Research Institute of China botanical garden Camellia (Camellia japonica L.) obtained by conventional methods. The camellia saponin A (Camellioside A) in the preparation of skin whitening agents and antioxidants in application. The invention has the advantages that: camellia saponin A (Camellioside A) is ecological compound, low cost, can inhibit melanin synthesis and improve the antioxidant capacity of UVB irradiation on cell, can in the preparation of skin whitening agents and antioxidants in application.

【技术实现步骤摘要】
山茶皂苷A（CamelliosideA）的应用
本专利技术涉及一种山茶皂苷A(CamelliosideA)的应用，属功效性化妆品

技术介绍
皮肤内黑色素含量直接决定肤色深浅，黑色素由黑素细胞合成与分泌。受遗传、紫外线等因素的影响，可导致黑色素代谢异常，黑素细胞分泌的黑色素增加，造成局部皮肤变黑，引起黄褐斑、雀斑、老年斑和炎症后色素沉着等。黑素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶、多巴色素互变酶、二羟基吲哚酸氧化酶等酶和蛋白作用下经多巴、多巴醌、多巴色素、二羟基吲哚等中间体逐步转化成为黑色素。酪氨酸酶(TYR)及酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)影响黑素细胞合成黑素的关键酶。抑制酪氨酸酶活性，降低酪氨酸酶相关蛋白1的表达均能减少黑色素的合成。紫外线辐射是皮肤物理性损伤的主要因素，尤其是中波紫外线(UVB)，可导致皮肤炎症、色素沉着、老化、皮肤癌。UVB主要作用于表皮角质形成细胞，增加其活性氧族(ROS)的产生，引起一系列氧化性损伤，导致SOD)含量下降，非酶自由基清除剂耗竭，过氧化最终产物丙二醛(MDA)大量积累，而损伤的皮肤抗氧化防御体系会导致更多ROS的产生，以正反馈形式加剧皮肤组织和细胞的损伤。超氧化物歧化酶对机体的氧化和抗氧化平衡起到了非常重要的作用，能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤，SOD的活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力；MDA的量常反应机体脂质过氧化的程度，MDA的高低间接反映了细胞受自由基攻击的严重程度。山茶(Camelliajaponica)属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物，其分布于云南、四川、台湾、山东、江西等省区。灌木或小乔木，高9米，嫩枝无毛。除了作为著名的观赏植物外，还有一定的药用价值。其性偏凉，味辛、苦，无毒；具有散瘀消肿，止血凉血之功效；可用于治疗血崩，吐血等出血症，及烫伤和跌打损伤等症。目前未见有抑制黑素细胞酪氨酸酶活性、降低TRP-1表达及对紫外线照射细胞的抗氧化作用的公开报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种山茶皂苷A(CamelliosideA)的应用。本专利技术是这样实现的：1、制备山茶植物活性化合物本专利技术的山茶植物活性化合物为山茶皂苷A(CamelliosideA)，经由如下步骤得到：a.选用山茶(CamelliajaponicaL.)，将5kg干燥的山茶枝叶粉碎，分别用75％乙醇热回流提取3次，时间依次分别为：3h、2h、2h，合并提取液，减压回收乙醇，得到粗提物。粗提物溶解于水中，经D-101大孔树脂柱层析，分别用水、80％乙醇和95％乙醇洗脱。回收溶剂得到80％乙醇洗脱部分和95％乙醇洗脱部分。b.将80％乙醇洗脱部分用乙醇溶解后，用400g硅胶(80-100目)拌样，2kg硅胶(200-300目)湿法装柱，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(20:1:0→10:1:0→8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，TLC检测后合并后得到三部分(Fr.1-3)。经过薄层层析TLC检测，发现Fr.3富含三萜皂苷类成分，因此主要对Fr.3(90g)进行分离纯化。用MCIgelCHP20P树脂柱对Fr.3脱色，乙醇-水梯度洗脱(30％→40％→50％→60％→70％→100)，皂苷集中在50-70％洗脱部位；再通过硅胶柱层析进行湿法装柱上样，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(8:2:0.2→7:3:0.5→1:1:0.5)，得到山茶皂苷A(CamelliosideA)粗品。粗品溶解于乙醇-水(2:1)中，得到结晶，再次重结晶后，过滤结晶，得到98％的山茶皂苷A(得率：0.06％)。2、黑素细胞酪氨酸酶抑制率的测定取对数生长期的小鼠黑素瘤B16细胞，消化，计数，将细胞接种于96孔板，接种密度为104个/孔，过夜后弃去培养液，分别加入100μl/孔的药液，阴性对照组为含溶剂DMSO的培养液，空白对照组为无细胞含相应溶剂DMSO的培养液，分别在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72小时后，弃上清液，PBS洗涤2次，每孔加入50μl含1％TritonX-100的PBS，低速震荡30min，放置于-80℃冰箱中1h，取出后37℃水浴40min，黑素细胞完全裂解。每孔加入100μl浓度为0.1％L-DOPA(PBS液配制)溶液，继续置于37℃孵育2h，用酶标仪测定在490nm处的吸光度。每组6孔，重复3次。酪氨酸酶抑制率＝1-[(药物组平均吸光值-空白组平均吸光值)/(阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值)]×100％3、酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1)表达的检测取对数生长期的小鼠黑素瘤B16细胞，接种于培养瓶中，密度为5000个/cm2，过夜培养后弃去培养液，分别加入药液培养72h。消化离心，用PBS液洗涤3次，加入60ul/瓶细胞裂解液(含1％PMSF、1％磷酸酶抑制剂)，震荡30min，使细胞充分裂解。匀浆离心，根据BCA法测定蛋白质浓度。根据测定的蛋白浓度，计算蛋白上样量上样，进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳，120V，电泳90min后将蛋白质转移到PVDF膜上，2.5A，13min。取膜，封闭液室温封闭2h，分别加入(1:200)多克隆兔抗鼠酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)抗体和(1:2000)内参GAPDH，4℃过夜。洗膜后，加入(1:5000)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温轻摇1h。充分洗膜后，做化学发光(ECL)，显影，采用凝胶成像分析软件分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，进行分析。计算所测目标蛋白/GAPDH比值，得到目标蛋白的相对含量。4、黑素细胞中黑素合成的检测取对数生长期的小鼠黑素瘤B16细胞接种于24孔板，过夜培养，弃去培养液，分别加入1ml/孔的药液，阴性对照组为含溶剂DMSO的培养液，空白对照组为无细胞含相应溶剂DMSO的培养液，分别在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养72小时后，弃上清，PBS洗涤2次，加入含1MNaOH溶液120ul/孔，80℃，水浴2h。将溶解液体吹匀转移至96孔板中(100ul/孔)，用酶标仪测定在405nm处的吸光度。每组3孔，重复3次。黑素合成抑制率＝1-[(药物组平均吸光值-空白组平均吸光值)/(阴性对照组平均吸光值-空白组平均吸光值)]×100％5、细胞中的抗氧化能力评价对数生长期的角质形成细胞HaCaT，以浓度为2×105个/mL，接种于6孔培养板，每孔2mL，分组加药处理12h,撤去药液后加入PBS,以60mJ/cm2的剂量照射UVB,24h后收集各组细胞，用4℃PBS洗2遍，反复冻融破碎细胞，将各管细胞悬液置于液氮中4s后，37℃水浴5min，按此操作反复冻融细胞4次，以充分破坏细胞并使其释放出细胞成分，4000r/min离心10min，收集上清液严格参照试剂盒说明分别测细胞内SOD和MDA水平。并用BCA法测定各组细胞内的蛋白浓度。本专利技术的山茶皂苷A(CamelliosideA)在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。本专利技术的有益效果在于：山茶植物活性化合物是生态化合物，成本低，具有抑制黑素合成和提高对UVB照射细胞的抗氧化能力，能够在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。附图说明图1为Westernblot检测酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1)的表达。图2显示与空白对照组相比，U本文档来自技高网...

【技术保护点】
山茶皂苷A(Camellioside A)在制备护肤美白剂及抗氧化剂中的应用。

【技术特征摘要】
1.山茶皂苷A(Camellioside...

【专利技术属性】
技术研发人员：何黎，吴文娟，刘海洋，周婷，倪伟，马骁，王飞飞，
申请(专利权)人：昆明医科大学第一附属医院，昆明贝泰妮生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53