一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法技术

一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法，本发明专利技术涉及一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。本发明专利技术的目的是为了解决现阶段检测原乳的乳蛋白率和乳脂率方法不能准确和全面地反映不同奶牛品种和个体的乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的问题。本发明专利技术方法为：一、牛乳的预处理；二、牛乳外泌体的制备；三、检测GlyRS和CAP1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝GlyRS含量/CAP1含量。本发明专利技术的GlyRS含量/CAP1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同时可以排除因其他因素对乳蛋白率和乳脂率的影响而不能有效判断乳腺合成能力的问题。本发明专利技术可应用于奶牛饲养领域。

【技术实现步骤摘要】
一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法
本专利技术涉及一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。
技术介绍
乳品质主要指乳蛋白率和乳脂率，是牛乳的重要经济指标。优良的牛乳具有较高的乳蛋白率和乳脂率，具有更好的乳品加工特性，因此市场价格也较高。在同样的饲养营养环境下，不同品种奶牛和同一品种奶牛的不同个体所生产的原乳的乳蛋白率和乳脂率却相差很大，乳腺合成乳蛋白、乳脂肪的能力是反映不同奶牛品种和个体乳腺的产乳品质差异的重要指标。乳腺合成乳蛋白、乳脂肪的能力由乳腺泌乳的基本单元乳腺上皮细胞中调控乳蛋白和乳脂肪合成的关键基因决定，乳腺细胞中这些基因表达的蛋白是重要的信号分子，能够响应奶牛机体刺激乳腺泌乳的氨基酸等营养信号、催乳素和雌激素等激素信号、生长因子等信号，调控乳蛋白和乳脂肪形成。这些功能基因表达的差异反映了乳腺上皮细胞合成乳蛋白、乳脂肪能力的差异。因此筛选乳蛋白率和乳脂率高的奶牛品种和个体是奶牛营养和遗传育种的重要任务之一。目前尚没有筛选乳蛋白率和乳脂率高的奶牛品种和个体的有效方法。通过检测原乳的乳蛋白率和乳脂率可以部分反映奶牛品种和个体生产原乳品质的差异，但由于乳蛋白率和乳脂率的差异除与乳腺的合成乳蛋白、乳脂肪等的能力有关外，还可能与泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代谢差异、肝脏生物转化的差异、所取牛乳样品的差异等有关，因此单纯检测原乳的乳蛋白率和乳脂率难以准确和全面地反映不同奶牛品种和个体的乳腺的合成乳蛋白和乳脂肪的能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现阶段检测原乳的乳蛋白率和乳脂率方法不能准确和全面地反映不同奶牛品种和个体的乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的问题，提供了一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法。本专利技术一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的预处理：取牛乳于-80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于0-4℃、2000-2500rpm的条件下离心25-30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的条件下离心30-40min，取上清；将上清于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀；将沉淀用0.01-0.02M的PBS溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀，将沉淀用0.01-0.02M的PBS溶液溶解，得到外泌体溶液，检测外泌体溶液纯度，合格后进行下一步操作；其中牛乳样品与0.01-0.02M的PBS溶液的体积比为1:20；三、取外泌体溶液15-20μl用于Westernblotting检测；检测蛋白为：GlyRS和CAP1，根据Westernblotting的灰度扫描结果，利用Image-ProPlus图像分析软件进行分析，得到GlyRS含量和CAP1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝GlyRS含量/CAP1含量，GlyRS含量/CAP1含量＞0。外泌体(exosome)是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡，直径约为30-150nm。外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，已发现不同外泌体中共计4万多种蛋白质、超3千种microRNA、超3千种mRNA。乳腺上皮细胞能够分泌外泌体到乳中，甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)和cAMP结合蛋白1(CAP1)在乳外泌体中存在，且和乳腺上皮细胞中的水平正向相关。通过检测乳中外泌体GlyRS和CAP1含量，结合对原乳的乳蛋白率和乳脂率的分析，可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力。目前外泌体提取最常用的方法是超速离心法，此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足。本专利技术利用超速离心法制备乳中外泌体，并利用肿瘤易感性基因101(tumorsusceptibilitygene，TSG101)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulatedprotein78，GRP78)、血管性血友病因子(vonWillebrandFactor，vWF)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)进行外泌体纯度检测。本专利技术首次发现了甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)和cAMP结合蛋白1(CAP1)分别是乳腺调控乳蛋白和乳脂肪合成的正向和负向关键调控因子。乳腺上皮细胞中GlyRS含量代表合成乳蛋白、乳脂肪能力，而CAP1含量代表抑制合成乳蛋白、乳脂肪的能力。通过对乳腺上皮细胞中GlyRS、CAP1等关键分子的检测以评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，可以科学、准确地反映奶牛乳腺的产乳品质潜力。Westernblotting检测GlyRS和CAP1含量，建立了奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的计算方法：GlyRS含量/CAP1含量；本方法利用GlyRS含量/CAP1含量的比值，避免了乳中外泌体纯度不足和制备量对结果的影响，将乳指标和乳腺基因表达能力结合在一起，全面反映了不同奶牛品种和个体合成乳蛋白和乳脂肪的能力。通过试验可知，对乳腺上皮细胞中GlyRS和CAP1关键分子的检测以评价乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的功能，GlyRS含量/CAP1含量可以反映乳腺合成乳蛋白和乳脂肪的能力，同时可以排除泌乳量的不同、奶牛瘤胃微生物的代谢差异、肝脏生物转化的差异、所取牛乳样品的差异等因素的影响。附图说明图1为实施例1中Westernblotting检测外泌体溶液纯度结果图；a为细胞裂解液；b为细胞培养液上清；c为制备的牛乳外泌体；图2为实施例1中Westernblotting检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛外泌体中GlyRS和CAP1含量的结果图；a为细胞裂解液；d为饲喂秸秆型粗饲料奶牛外泌体；e为苜蓿型粗饲料奶牛外泌体；图3为实施例1中饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力示意图；其中f为饲喂秸秆型粗饲料奶牛，g为饲喂苜蓿型粗饲料奶牛；图4为实施例1中利用乳成分分析仪检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳蛋白率的结果示意图；其中f为饲喂秸秆型粗饲料奶牛，g为饲喂苜蓿型粗饲料奶牛；图5为实施例1中利用乳成分分析仪检测饲喂秸秆型粗饲料奶牛和苜蓿型粗饲料奶牛乳脂率结果示意图；其中f为饲喂秸秆型粗饲料奶牛，g为饲喂苜蓿型粗饲料奶牛。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法：一、牛乳的预处理：取牛乳于-80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于0-4℃、2000-2500rpm的条件下离心25-30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的条件下离心30-40min，取上清；将上清于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀；将沉淀用0.01-0.02M的PBS溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀，将沉淀用0.01-0.02M的P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法，其特征在于该制备方法为：一、牛乳的预处理：取牛乳于‑80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于0‑4℃、2000‑2500rpm的条件下离心25‑30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于0‑4℃、12000‑13000rpm的条件下离心30‑40min，取上清；将上清于0‑4℃、100000‑110000rpm的条件下离心2‑2.5h，取沉淀；将沉淀用0.01‑0.02M的PBS溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于0‑4℃、100000‑110000rpm的条件下离心2‑2.5h，取沉淀，将沉淀用0.01‑0.02M的PBS溶液溶解，得到外泌体溶液，检测外泌体溶液纯度，合格后进行下一步操作；其中牛乳样品与0.01‑0.02M的PBS溶液的体积比为1:20；三、取外泌体溶液15‑20μl用于Western blotting检测；检测蛋白为：GlyRS和CAP1，根据Western blotting的灰度扫描结果，利用Image‑Pro Plus图像分析软件进行分析，得到GlyRS含量和CAP1含量；四、奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力＝GlyRS含量/CAP1含量，GlyRS含量/CAP1含量＞0。...

【技术特征摘要】
1.一种利用牛乳检测奶牛乳腺合成乳蛋白和乳脂肪能力的方法，其特征在于该制备方法为：一、牛乳的预处理：取牛乳于-80℃冻存备用，得到牛乳样品；二、牛乳外泌体的制备：将牛乳样品于0-4℃、2000-2500rpm的条件下离心25-30min，去除沉淀的细胞和漂浮的脂肪球，得到脱脂乳；将脱脂乳于0-4℃、12000-13000rpm的条件下离心30-40min，取上清；将上清于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀；将沉淀用0.01-0.02M的PBS溶解，得到外泌体初次溶液；将外泌体初次溶液于0-4℃、100000-110000rpm的条件下离心2-2.5h，取沉淀，将沉淀用0.01-0.02M的PBS溶液溶解，得到外泌体溶液，检测外泌体溶液纯度，合格后进行下一步操作；其中牛乳样品与0.01-0.02M的PBS溶液的体积比为1:20；三、取外泌体溶液15-20μl用于Westernblotting检测；检测蛋白为：GlyRS和CAP1，根据Westernblotting的灰度扫描结果，利用Image-ProPlus图像分析软件进行分析，得到GlyRS含量和CAP...

【专利技术属性】
技术研发人员：高学军，郭思圻，张明辉，刘营，敖金霞，曲波，袁肖寒，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23