检测远志中sibiricose A5与sibiricose A6含量的方法技术

本发明专利技术公开一种检测远志药材中sibiricose A5与sibiricose A6含量的PCR引物及方法，该PCR引物为：上游引物：5’‑AGATGGTGAGCGTGATT‑3’；下游引物：5’‑CAAGCCCTCTTTCAATA‑3’。该方法包括：提取远志样品的基因组DNA；以基因组DNA为模板，利用该特异性引物进行PCR扩增；通过PCR扩增产物检测其所含化合物sibiricose A5与sibiricose A6的含量，能扩增出长度为629bp条带的远志样品，其所含化合物sibiricose A5与sibiricose A6的含量较低。本发明专利技术所述PCR引物及方法，具有方便快捷、准确性高的优点，在远志药材的良种选育中应用，可大大缩短育种时间，提高育种效率。

Method for detecting contents of sibiricose A5 and sibiricose A6 in Polygala tenuifolia Willd

PCR primer and the invention discloses a method for detection of sibiricose A5 in p.tenuifolia and sibiricose A6 content, the PCR primers for the upstream primer: 5 'AGATGGTGAGCGTGATT 3'; downstream primer: 5 \CAAGCCCTCTTTCAATA 3\. The method includes: extracting genomic DNA samples of Polygala; genomic DNA as template, amplified by PCR using the specific primers to detect the content of the product; sibiricose A5 and sibiricose compounds containing A6 amplified by PCR amplified 629bp bands Polygala sample length, the content of compound sibiricose A5 and sibiricose A6 is lower. The PCR primer and the method of the invention have the advantages of convenience, quick and high accuracy, and can be applied to the breeding of Polygala tenuifolia Willd, which can greatly shorten the breeding time and improve the breeding efficiency.

【技术实现步骤摘要】
检测远志中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量的方法
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测远志药材中化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6含量高低的PCR引物及方法。
技术介绍
远志(PolygalatenuifoliaWilld.)始载于《神农本草经》，列为上品，且为常用中药。性温，味苦、辛，具有安神益智、祛痰消肿等功效。经现代研究发现，远志药材的主要有效成分包括皂苷类、糖酯类、口山酮类及生物碱类等，具有抑菌、抗炎、提高认知、改善记忆能力、抗老年痴呆、抗抑郁、抗肿瘤、抗衰老等药理作用。中药材药效的强弱与药材质量的优劣密切相关，而药材质量的优劣与药材中所含主要化学成分含量的高低紧密相关。研究表明，糖酯类化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6具有较强的抗痴呆及抗抑郁活性。目前对化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6的定性及定量分析，主要集中于提取分离、HPLC(UPLC)含量测定、指纹图谱、一测多评或代谢组学等方法，但这些方法存在着诸多不足：提取分离具有极大的盲目性，耗时长，同时还不可避免的涉及到大量的重复性工作；HPLC(UPLC)含量测定、指纹图谱、一测多评或代谢组学等方法，所用仪器比较昂贵，对实验操作人员的技术要求较高，难以普遍推广应用。中药材中次生代谢物的累积程度及含量变化又受生长年限的影响，中药材尤其是根茎类中药材，生长年限较长，一般以2-3年生为主，测定中药材中所含化合物的含量需要较长时间。化合物含量是多基因控制的复杂性状，不同远志样品间化合物含量差异较大。sibiricoseA5与sibiricoseA6具有相同的母核结构，其含量可能受同一类型或同一个基因控制。故本专利技术筛选出与sibiricoseA5与sibiricoseA6含量相关的特异性DNA分子条带，目的是针对该特异性条带设计出可检测sibiricoseA5与sibiricoseA6含量高低的特异性PCR引物，并希望得到实际应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量高低的PCR引物；以及利用该PCR引物检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量高低的方法。该方法具有方便快捷、准确性好的优点，可在远志药材的良种选育中应用，可大大缩短育种时间，提高育种效率。本专利技术提供的一种检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量的PCR引物，该特异性PCR引物如下所示：上游引物：5’-AGATGGTGAGCGTGATT-3’(SEQIDNo.1)；下游引物：5’-CAAGCCCTCTTTCAATA-3’(SEQIDNo.2)。本专利技术提供的一种检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量的方法，包括如下步骤：(1)提取远志样品的基因组DNA；具体为采用CTAB法提取基因组DNA；由于各个发育时期的个体、各个组织器官甚至细胞的DNA保持一致，不受环境的影响且遗传稳定，故可选取任意生长时期、任意组织部位的远志样品提取DNA。(2)以所述基因组DNA为模板，利用所述的PCR引物进行PCR扩增；其中，采用特异性引物进行PCR扩增时，PCR扩增反应体系优选为25μL，包括：3μL模板DNA，10μM上下游引物各1μL，12.5μL2×EasyTaqPCRSuperMix，用灭菌超纯水补足反应体积；PCR扩增程序优选为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min，10℃10min。(3)通过PCR扩增产物检测化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6的含量；利用1.0％-2.0％琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR扩增产物，在紫外线下观察琼脂糖凝胶，能扩增出长度为629bp条带的远志样品，其所含化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6的含量较低。所述琼脂糖凝胶浓度优选为1.5％。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：(1)利用本专利技术的引物可准确高效地检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量的高低，进而对远志药材品质进行初步鉴定；(2)利用本专利技术的引物可对远志种子或者在苗期对远志药材的幼嫩叶片进行检测，大大提高了化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6含量较高的远志优良品种的筛选效率，加快了远志药材育种的进程，缩短了育种周期。附图说明图1为特异性引物分别扩增7份远志样品的琼脂糖凝胶电泳图，其中1-7分别为7个远志药材样品，5-7号远志药材PCR扩增产物长度为629bp；M为DL2000DNAMarker，由上至下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp。具体实施方式以下实施例用于说明本方法，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork：GoldSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用试剂均为市售商品。本专利技术所提供的特异性鉴别引物(上游引物：5’-AGATGGTGAGCGTGATT-3’；下游引物：5’-CAAGCCCTCTTTCAATA-3’)，其设计的具体方法为：首先对远志药材中化合物sibiricoseA5与sibiricoseA6进行含量测定，结合ISSR(inter-simplesequencerepeat)分子标记技术，利用SPSS16.0软件筛选出与化合物sibiricoseA5及sibiricoseA6含量相关的特异性条带，对特异性条带进行胶回收、克隆测序，并利用PrimerPremier5.0软件针对目标序列设计出特异性PCR引物。实施例1远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量高低的检测方法1.样品来源本实施例中采用的远志药材为山西省不同产地收集到的7批远志药材的干燥根，远志样品具体信息见表1。表1远志样品信息表2.基因组DNA的提取将上述样品，每个样品取约60mg，用液氮研磨成粉末，利用CTAB法提取DNA。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，型号为：CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒(货号：DN14)，50次。具体实验方法参照试剂盒说明书。3.PCR扩增以步骤2所得到的每一个远志药材基因组DNA作为PCR扩增的DNA模板，以5’-AGATGGTGAGCGTGATT-3’为上游引物，5’-CAAGCCCTCTTTCAATA-3’为下游引物进行常规PCR扩增。PCR扩增反应体系为25μL，包括：3μL模板DNA，10μM上下游引物各1μL，12.5μL2×EasyTaqPCRSuperMix，用灭菌超纯水补足反应体积。PCR扩增程序为：93℃5min；93℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃5min；10℃10min，获得每一个远志药材的PCR扩增产物。4.远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量高低的检测将每一种远志药材的扩增片段上样于浓度为1.5％的琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测远志药材中sibiricose A5与sibiricose A6含量的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物如下所示：上游引物：5’‑AGATGGTGAGCGTGATT‑3’；下游引物：5’‑CAAGCCCTCTTTCAATA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量的PCR引物，其特征在于，所述PCR引物如下所示：上游引物：5’-AGATGGTGAGCGTGATT-3’；下游引物：5’-CAAGCCCTCTTTCAATA-3’。2.一种检测远志药材中sibiricoseA5与sibiricoseA6含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取远志样品的基因组DNA；(2)以所述基因组DNA为模板，利用如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张福生，王丹丹，闫艳，张建琴，秦雪梅，张丽增，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14