一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法技术

本发明专利技术属于家畜免疫学技术领域，具体涉及一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法。该方法简称为ChIP。本发明专利技术专门针对猪组织进行优化设计，采用组织裂解液与Dounce研磨器相结合，开发适合猪组织匀浆的方法、步骤和流程，使组织裂解充分，组织悬液均匀，得到的chromatin量大且质量高，后续ChIP‑Seq实验的峰图质量高。本发明专利技术简单、快速、有效的制备组织悬液，能满足ChIP‑Seq实验的核心要求，为开展猪的组织表观基因组学研究提供了有效途径。

A method of chromatin immunoprecipitation for swine tissues

The present invention belongs to the field of livestock immunology technology, and specifically relates to a method of chromatin immunoprecipitation treatment for swine tissues. This method is abbreviated as ChIP. The invention specifically for pig tissue optimized by tissue lysates with Dounce grinder combination method, suitable for the development of pig tissue procedures and processes, the organization fully cracked tissue suspension uniform, chromatin amount of large and high quality, the subsequent ChIP Seq experiment peak of high quality. The invention is simple, fast and effective preparation of tissue suspension can meet the experimental requirements of core ChIP Seq, genome view provides an effective way for carrying out the study of surface pig tissue.

【技术实现步骤摘要】
一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法
本的专利技术属于家畜免疫学
，具体涉及一种猪组织染色质免疫沉淀(ChIP)处理方法。
技术介绍
目前有关3D基因组的研究越来越火热,组蛋白修饰也成为其中的热点,其对基因表达调控起着至关重要的作用。研究3D基因组的方法有很多,如:3-C(chromosomeconformationcapture),4-C(chromosomeconformationcapture-on-chip),5-C(chromosomeconformationcapturecarboncopy),ChIP(chromatinimmunoprecipitation),ChIA-PET(chromatininteractionanalysisbypaired-endtagsequencing)等技术(BonevandCavalli2016),并且这些技术尤其ChIP在人与小鼠无论细胞还是组织上已经应用地成熟,而有关在猪上面的ChIP技术却一直没有系统的研究方法。ChIP方法,是指在活细胞状态下,通过甲醛固定蛋白质-DNA复合物,并将其打断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,然后特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片段的纯化与后期检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。猪组织水平的表观基因组学研究一直备受关注，通过组织ChIP-Seq手段解析机体生长发育、繁殖、抗病等规律是目前本领域研究的热点和难点。由于组织前处理技术的缺乏，使得组织ChIP-Seq的研究停滞不前，是目前该领域亟待解决的关键技术。该技术的难点在于如何得到蛋白质-DNA复合物，在细胞中，通过细胞膜裂解液以及细胞核裂解液发挥作用得以释放复合物，所以在细胞水平该技术已经被广泛运用。然而，在许多生物中细胞模型并不能包括所有的研究领域，于是领域逐渐扩大到组织，并且有关人与小鼠各个组织的ChIP数据已经发表了很多(RoadmapEpigenomicsetal2015；Yueetal2014)。然而在猪上，细胞系的稀少也是阻碍猪3D基因组发展的一个重要因素，所以专利技术一种能够在猪组织上开展的ChIP方法是很关键的。而在组织上开展ChIP的难点也在于组织的处理。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于染色质免疫沉淀技术(ChIP)的猪组织处理方法。通过对组织进行特殊处理，实现ChIP技术在猪组织上的成功应用。本专利技术方法专门针对猪组织进行优化设计，采用组织裂解液与Dounce研磨器相结合，开发适合猪组织匀浆的方法、步骤和流程，使得组织裂解充分，组织悬液均匀，得到的chromatin量大质量高，后续ChIP-Seq实验的峰图质量高。本专利技术通过以下方案实现本专利技术提供了一种优化的操作的方法，专门化用于在猪组织上开展ChIP实验的前期处理流程，在处理细胞方法的基础上进行了改进。由于组织的复杂结构，细胞膜裂解液采用Tsankova等报道的配方(Tsankovaetal2004)，1％的细胞核裂解液(FA)则是使用50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，150mM的NaCl，1mM的EDTA，1％浓度的TritonX-100，0.1％浓度的SOD和1％浓度的SDS等成分。除此之外，在裂解时不仅仅需要试剂发挥作用，还需要通过机械研磨对组织进行匀浆裂解。本专利技术使用的研磨器材是Douncehomogenizer，该器材不仅能起到研磨的作用，还能对组织进行匀浆处理，使组织达到裂解均一的效果。本专利技术对染色质进行打断时，是将其重悬于0.1％的FA中(含有50mM的HEPES，150mM的NaCl，1mM的EDTA，1％浓度的TritonX-100，0.1％浓度的SOD和0.1％浓度的SDS)中，其目的是避免DNA的降解。由于研磨以及打断的过程会产生一定的热量，所以我们在多个裂解液中通过适量添加蛋白酶抑制剂，从而避免了复合体中蛋白质的降解，进而提高沉淀所得的DNA的量。具体地，本专利技术的技术方案如下所述：一种猪组织染色质免疫沉淀(ChIP)处理方法，包括组织的前处理和在细胞中做染色质免疫沉淀,即ChIP，其特征包括下列步骤：(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50mL离心管中，将猪组织剪成约1-3mm3的小块；(2)加入23.75mL的1％甲醛溶液，在室温下处理15min，在组织被充分晃动条件下进行交联；(3)加入1.25mL的2.5M的甘氨酸至终浓度为125mM时终止交联，在室温下处理5min，继续在交联条件下使组织晃动，5min后，在2500rpm，25℃下离心5min；(4)弃上清，取沉淀，用20mL复配的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后以2500rpm，25℃下离心5min；将所得的沉淀再次用20mL复配的磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min，最后弃上清；其中：复配的磷酸盐缓冲液是在50mL的磷酸盐缓冲液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(5)加入10mL复配的细胞膜裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至Dounce匀浆器中，将所述的Dounce匀浆器提前放在冰上，在中空把手中装上冰块，在冰上慢慢研磨，避免产生太多热量，直到组织块被磨碎且成为匀浆状态；将匀浆好的组织转移至新的50mL离心管中，在5500g，4℃下离心5min，将所得的沉淀再次用10mL复配的细胞膜裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；其中：复配的细胞膜裂解液是在50mL细胞膜裂解液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(6)用6mL，1％的细胞核裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至Dounce匀浆器中，置于室温下，在室温下研磨5min，将匀浆好的组织转移至新的50mL离心管中，5500g，25℃下离心5min，得到的沉淀再次用6mL，1％的细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；(7)弃上清，留白色透明状的沉淀，用15mL复配的0.1％细胞核裂解液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后5500g，4℃下离心5min，得到的沉淀再次用15mL复配的0.1％细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；其中，复配的0.1％细胞核裂解液是在50mL0.1％的细胞核裂解液溶液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(8)用6-10mL复配的0.1％细胞核裂解液重悬，立即进行超声波裂解，超声波参数为：功率为34％；处理时间:6min；操作20s,停30s；(9)在细胞中做染色质免疫沉淀,即ChIP(后续步骤同细胞中的ChIP实验流程)；其中：1)细胞膜裂解液的配制：Tris·HCl8.010mM；NaCl10mM；NP-400.2％；补充双蒸水195.6mL；2)1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)50mM；NaCl150mM；EDTA1mM；TritonX-1001％；SOD0.1％；SDS1％；补充双蒸水798mL；3)0.1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)50mM；NaCl150mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪组织染色质免疫沉淀(ChIP)处理方法，包括在组织的前处理和在细胞中做染色质免疫沉淀,即ChIP，其特征包括下列步骤：(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50mL离心管中，将猪组织剪成约1‑3mm

【技术特征摘要】
1.一种猪组织染色质免疫沉淀(ChIP)处理方法，包括在组织的前处理和在细胞中做染色质免疫沉淀,即ChIP，其特征包括下列步骤：(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50mL离心管中，将猪组织剪成约1-3mm3的小块；(2)加入23.75mL的1％甲醛溶液，在室温下处理15min，在组织被充分晃动条件下进行交联；(3)加入1.25mL的2.5M的甘氨酸至终浓度为125mM时终止交联，在室温下处理5min，继续在交联条件下使组织晃动，5min后，在2500rpm，25℃下离心5min；(4)弃上清，取沉淀，用20mL复配的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后以2500rpm，25℃下离心5min；将所得的沉淀再次用20mL复配的磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min，最后弃上清；其中：复配的磷酸盐缓冲液是在50mL的磷酸盐缓冲液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(5)加入10mL复配的细胞膜裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至Dounce匀浆器中，将所述的Dounce匀浆器提前放在冰上，在中空把手中装上冰块，在冰上慢慢研磨，避免产生太多热量，直到组织块被磨碎且成为匀浆状态；将匀浆好的组织转移至新的50mL离心管中，在5500g，4℃下离心5min，将所得的沉淀再次用10mL复配的细胞膜裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；其中：复配的细胞膜裂解液是在50mL细胞膜裂解液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(6)用6mL，1％...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹建华，任瑞敏，黄英，孙艳，王昇，赵书红，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42