梨PbrmiR397a及其应用制造技术

本发明专利技术公开了梨PbrmiR397a及其应用。一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的microRNA基因(PbrmiR397a)，其前体核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。通过农杆菌介导遗传转化方法将PbrmiR397a转化烟草，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明专利技术克隆的PbrmiR397a基因具有减少木质素合成的功能。PbrmiR397a基因的发现，为减少木质素合成的分子育种提供新的基因资源。由于PbrmiR397a基因具有同时靶向调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。

Pear PbrmiR397a and its application

The present invention discloses pear PbrmiR397a and its application. An isolated from \Dangshan pear\ to regulate pear stone cell development microRNA gene (PbrmiR397a) and its precursor nucleotide sequence of SEQ ID No.1 shown. PbrmiR397a will be transformed into tobacco by Agrobacterium mediated genetic transformation, transgenic plants, the biological function of validation showed that the PbrmiR397a gene cloned by the invention can reduce the lignin synthesis function. The discovery of PbrmiR397a gene provides new gene resources for molecular breeding of reducing lignin synthesis. Because PbrmiR397a gene has the advantage of targeting multiple genes at the same time, it provides a more efficient way for molecular breeding.

【技术实现步骤摘要】
梨PbrmiR397a及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及梨PbrmiR397a及其应用，具体涉及从‘砀山酥梨’中分离、克隆得到一个调控梨果实石细胞发育的microRNA基因(PbrmiR397a)及其应用。
技术介绍
中国每年的梨产量占到了全球产量的60％以上。但由于果实品质较差，梨的出口量只占全世界梨出口量的15％左右，而且出口价格明显低于平均出口价格。梨石细胞含量是影响梨果实品质的重要因素之一。梨果实石细胞是由薄壁细胞在其细胞壁上沉积了大量木质素而形成的厚壁细胞。因此木质素的合成是影响石细胞发育的关键因素[1]。木质素的含量与组成在不同植物、组织、细胞和亚细胞位置差异很大，且受发育阶段和环境的影响[2]。双子叶植物中主要是G-木质素和S-木质素，并有微量的H-木质素；单子叶植物中G-木质素和S-木质素含量差不多，并含有比双子叶植物多的H-木质素。通常G-木质素和S-木质素的含量要比H-木质素多。木质素不易进行化学降解，其含量直接影响作物转化为生物燃料和纤维质产物的能力[3]。木质素的研究已在多种植物中广泛开展，包括模式植物拟南芥、林木植物(杨树、桉树)、作物(玉米、苜蓿、水稻、柳枝稷、甘蔗)以及少量的果蔬(竹笋、枇杷)等，但不同植物的木质素相关研究目的不尽相同。拟南芥作为模式植物，主要用于开展一些基础研究；桉树等林木植物作为造纸原料，柳枝稷、甘蔗等作为生物能源植物，木质素含量是制约其产物转化的重要因素，因此，研究目标在于获得积累较少木质素的植株或是形成更容易被化学方法降解的木质素[4]。MicroRNAs(MiRNAs)是近年来备受关注的一类非编码RNA，它在生物中广泛存在，长度为19-25nt。在植物中，由具有茎环结构的miRNA前体经过DCL1(Dicer-like1)酶的两步切割产生成熟miRNA。成熟miRNA与Argonaute蛋白结合进入RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通过碱基互补配对的方式与靶基因的mRNA结合导致靶基因的表达被抑制，其作用机制主要包括引起靶基因mRNA降解和抑制翻译两种情况。miRNA在生物体的不同发育阶段和不同部位，存在着时间上和空间上的特异表达，对生物体的转录后基因调控起着关键作用[5]。随着园艺植物miRNAs研究的不断深入，越来越多的证据表明miRNA在园艺植物生长发育，以及响应生物胁迫与非生物胁迫方面都起着重要的调节作用。有关miRNAs调控木质素的研究最早出现在Acaciamangium上。通过对Acaciamangium高木质素含量(41％)和低木质素含量(21％)次生木质部的两个样品进行高通量测序，得到了两个miRNAs数据库。经过比较发现这些miRNAs预测的靶基因为一些转录因子，而这些转录因子在木质素的合成过程中，起着重要的作用[6]。随后又发现在Acaciamangium中，有6个高度保守的miRNAs家族参与次生细胞壁的合成。其中miR166家族在韧皮部和木质部中表达量上存在着巨大的差异。MiR166家族的miRNAs预测的靶基因(HD-ZIPIII、C4H、CAD、CCoAOMT)在木质素的合成过程中，担任着重要的角色[7]。在木本植物的模式植物毛果杨(Populustrichocarpa)中，miR397的靶向基因为49个漆酶基因。MiR397过量表达的转基因毛果杨中，漆酶基因的表达量全部下调，而且与野生型相比茎干中木质素含量下降40％[8]。有关MiRNAs的大部分信息来源于模式作物，如拟南芥、杨树等，但有关果树的MiRNAs的研究则非常有限。本专利技术以‘砀山酥梨’为试材，利用同源克隆技术，克隆得到梨PbrmiR397a基因的前体序列，构建过量表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化烟草使其过量表达，证明其可能参与烟草茎杆维管束的发育，从而扩展了梨果实石细胞形成的分子调控途径。另外，克隆梨中调控木质素合成的基因很大程度上提高作物改良和育种的效率，对农业生产也具有非常重要的理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种调控梨果实木质素合成的PbrmiR397a基因。本专利技术的另一目的是提供该基因的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：分离来自‘砀山酥梨’具有调控梨果实木质素合成的PbrmiR397a基因，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，包含107nt的前体核苷酸序列。含有本专利技术所述PbrmiR397a基因的重组表达载体。所述的重组表达载体，优选以pCAMBIA1301为出发载体，所述PbrmiR397a基因的插入位点为BglII和BstEII之间。含有本专利技术所述PbrmiR397a基因的宿主菌。克隆本专利技术所述PbrmiR397a基因序列的引物对，上游引物PbrmiR397a-F1序列如SEQIDNo.2所示，下游引物PbrmiR397a-R1序列如SEQIDNo.3所示。本专利技术所述的PbrmiR397a重组过量表达载体在减少烟草木质素合成的应用。有益效果与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和效果：1.PbrmiR397a基因的发现，为减少木质素合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业成本和实现环境友好。2.通过农杆菌介导遗传转化方法将miRNA转化烟草，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本专利技术克隆的PbrmiR397a基因具有同时靶向抑制多个基因表达的功能，从而减少烟草木质素合成的功能。PbrmiR397a基因这种能同时调控多个基因的优点，为分子育种提供更高效地途径。附图说明图1为本专利技术PbrmiR397a基因前体序列形成的stem-loop结构图。图2为本专利技术pCAMBIA1301-PbrmiR397a载体结构示意图。图3为PbrmiR397a基因转基因植株PCR鉴定图。其中，利用PbrmiR397a基因特异引物PCR鉴定烟草转基因植株。M：DL2000Marker，1：阳性对照，2：阴性对照，3，野生型烟草，4-23：转基因株系；具有特异条带的为转基因植株，没有特定条带的为假阳性植株。图4为本专利技术PbrmiR397a基因在转基因植株的基因表达量分析图。WT为野生型，其余编号：转基因株系。图5野生型及转基因烟草植株组织学分析。其中：WT：野生型；397a为转基因株系。(a)-(d)为甲苯胺蓝染色，(e)-(f)405nm下木质素的自发荧光，(g)-(h)透射电镜示意图图6野生型及转基因烟草植株木质部切片分析。(a)木质部宽度，(b)木质部细胞次生细胞壁厚度。*表示差异显著，**表示差异极显著。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可以对本专利技术做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1PbrmiR397a基因分离克隆从‘砀山酥梨’叶片中抽提DNA，用于扩增PbrmiR397a基因前体序列。DNA抽提使用植物基因组提取试剂盒(购自成都福际，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)。扩增基因引物对为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。50μL的反应体系中包括200ngD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的microRNA基因PbrmiR397a，其前体核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离自‘砀山酥梨’具有调控梨果实石细胞发育的microRNA基因PbrmiR397a，其前体核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。3.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于以pCAMBIA1301为出发载体，权利要求1所述基因的插入位点为BglII和BstEII之间。4.含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊，薛程，张绍铃，秦梦帆，谷超，齐开杰，王德孚，谢智华，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32