一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒及方法，属于细胞生物学技术和再生医学领域。该试剂盒和方法针对当前将成纤维细胞转分化为成骨细胞样细胞技术普遍存在的需载体介导和转基因操作、实验步骤复杂、实验技术水平要求高、产生的成骨细胞安全性较差等问题，发明专利技术了一种非载体介导的、利用鱼卵母细胞提取物直接诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的方法和试剂盒。由于通过该方法及试剂盒获得的成骨细胞样细胞不涉及载体介导和外源基因插入，因此不存在载体构建环节，实验操作相对简单，产生的成骨细胞样细胞安全性也相对较好，在骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒及方法
本专利技术涉及一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒及方法，属于细胞生物学技术和再生医学领域。
技术介绍
近年来，我国每年由于外伤、感染及肿瘤等原因造成机体骨缺损或骨损伤的患者达数百万例。自体骨移植不但给患者造成额外的身体创伤，同时给患者带来严重的心理和生理负担，而异体骨虽然可成为临床上自体骨移植的替代材料，但由于供体有限，难以大幅应用，同时异体骨移植还存在免疫排斥反应、并可能存在传染疾病的风险等问题，因而也难以成为骨病治疗的理想策略。随着骨组织工程和再生医学的发展，将成骨细胞与生物支架结合，通过体外培养、构建成复合材料后移植到骨损伤部位，随着生物支架的不断降解和吸收，成骨细胞不断增殖并分泌细胞因子和基质，从而实现对骨损伤部位的治疗和修复（VacantiCA,etal.,PlastReconstrSurg,1991,88(5):753-759;CaoY,etal.,TransplantProc,1994,26(6):3390-3392）。在骨组织工程中，获得较为理想的种子细胞是实现骨损伤有效治疗和修复的最基本和最核心的要素之一。目前认为，理想种子细胞应当具备以下基本条件：（1）取材方便，对机体损伤小；（2）体内、外生长和增殖能力较强，能在较短时间内获得足够数量的细胞；（3）体外、内的成骨能力较强；（4）具有稳定的生物学功能，成骨后能够稳定保持与正常骨细胞相似的生物学特性并维持一定时间；（5）良好的材料和组织相容性，能够在支架材料上大量增殖，在体内环境能保持良好的生物学特性。当前，种子细胞的来源主要有成骨细胞、骨髓基质细胞、基因修饰细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞等。成骨细胞是骨组织工程中使用的比较经典的种子细胞类型，通常来源于骨组织或骨膜，其在体外和体内均具有较强的成骨能力（VacantiCA,etal.,TransplantProc,1993,25:1019-1021;CastoldiM,etal.,CellBiolInt,1997,21(1):7-16），其培养条件也相对简单，细胞易存活（HankeyDP,etal.,ActaOrthopScand,2001,72(4):395-403）。但是成骨细胞取材会对供体造成损伤，在临床上难以广泛应用，此外成骨细胞易于衰老，这也限制了成骨细胞在临床上的应用。骨髓基质细胞（Bonemarrowstromalcells,BMSCs）是一种可形成类骨和类软骨物质的细胞类型（王萍，等，中国临床康复，2006,10(41):130-132）。由于BMSCs相对容易获得，体外培养较为容易，从成体骨髓中分离的BMSCs仍保持分化潜能，可用来修复骨骼肌组织损伤和大块骨缺损（BiancoP,etal.,StemCells,2001,19(3):180-192;QuartoR,etal.,NEnglJMed,2001,344(5):385-386）。但是，BMSCs是多个细胞类群的集合，具有不确定的分化特征，此外，随着培养时间的延长，BMSCs易于失去增殖潜能、降低生长速率、细胞形态发生改变、端粒变短以及细胞衰老等问题（BanfiA,etal.,TissueEng,2002,8(6):901-910），同时BMSCs体外培养的条件要求较高，培养条件的改变会严重影响BMSCs的分化潜能。基因修饰细胞是指利用基因工程技术将种子细胞进行基因修饰，以实现种子细胞特定的功能能力，研究表明，经过基因修饰的骨髓基质细胞、间充质干细胞均能够较好向成骨细胞分化，参与新骨的生成（MariePJ,etal.,HistolHistopathol,2002,17(3):877-885;ChengSL,etal.,CalcifTissueInt,2001,68(2):87-94）。但是，目前基因修饰细胞大多需要病毒载体介导才能产生，这势必为临床应用带来安全隐患，同时获取基因修饰细胞需要较高的技术和条件，这些因素都限制了基因修饰细胞的研究和应用。目前，干细胞是组织工程较为常用的种子细胞，在特定条件下，能够分化为特定细胞类型，参与组织损伤修复。但是，由于胚胎干细胞的免疫原性较差，在体内易形成畸胎瘤，更为重要的是破坏胚胎存在严重的伦理问题。间充质干细胞是存在于骨髓、脐带血、脂肪组织、肌肉组织、以及牙髓质等部位的干细胞类型，来源于这些组织的干细胞在特定培养条件下能够向成骨细胞分化（PhinneyDG，Journalofcellularbiochemistry,2002,85(S38):7-12；CovasD,etal.,BrazilianJournalofMedicalandBiologicalResearch,2003,36(9):1179-1183;KestendjievaS,etal.,Cellbiologyinternational,2008,32(7):724-732;HattoriH,etal.,CellsTissuesOrgans,2004,178(1):2-12;KurodaR,etal.,Arthritis&Rheumatism,2006,54(2):433-442;AlessandriG,etal.,Thelancet,2004,364(9448):1872-1883;YamazakiH,etal.,StemCells,2007,25(1):78-87）。间充质干细胞的最大特点在于，其在体外能够较长时间保持干细胞特性、组织分布较为广泛、异体移植免疫排斥较小等，是骨组织工程中较具应用前景的种子细胞类型，其存在的最大问题是干细胞来源存在条件限制。诱导多能干细胞（Inducedpluripotentstemcells,iPSCs）的专利技术开辟了干细胞来源的新途径，为组织工程和再生医学种子细胞来源提供了新方法。目前，利用iPSCs已分化出多个类型的细胞和组织，这其中包括骨和软骨组织（HongSG,etal.,CellReports,2014,7(4):1298-1309）。由于iPSCs发育具有全能分化特性、不涉及伦理问题，在临床上进行骨损伤治疗和修复方面具有广阔的应用前景。但是将iPSCs应用于临床之前需着重考虑并解决以下几个问题：（1）iPSCs的安全性，由于四转录因子介导方法产生的iPSCs在重编程水平上更接近胚胎干细胞，是当前较为常用的iPSCs产生方法，但是，该方法需要病毒载体的介导，并涉及重编程细胞基因组的改变，因此，iPSCs的安全性相对较差；（2）利用mRNA和microRNA等方法进行诱导时，由于这些物质易于降解，因此，在诱导过程中需要不断加入mRNA和microRNA等物质，因而，该重编程方法的实验操作较为繁琐、难度相对较大、重复性相对较差；（3）化学小分子物质能够显著提高重编程的效率，诱导方法也较为简单，目前已有实验室报道了可以利用全化学分子进行成体细胞重编程，但是目前全化学分子诱导方法依赖多种化学分子组合，该方法的诱导效率低，诱导也较为困难，且化学分子对基因组的稳定性目前仍不十分清楚。转分化（Trans-differentiation）也称谱系重编程（L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒，其特征在于该试剂盒的成份包括：鱼卵母细胞提取物、基础培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素、抗坏血酸、β‑甘油磷酸钠、地塞米松、茜素红染液。

【技术特征摘要】
1.一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒，其特征在于该试剂盒的成份包括：鱼卵母细胞提取物、基础培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、茜素红染液。2.一种采用权利要求1所述一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的试剂盒，其特征在于，鱼卵母细胞提取物蛋白浓度为10mg/ml，成骨细胞诱导分化培养基包含下列成份：基础培养基，10%的胎牛血清，10nmol/L的地塞米松，50μmol/L的抗坏血酸，10mmol/L的β-甘油磷酸钠，100U/ml的青霉素和100mg/L的链霉素。3.一种利用鱼卵母细胞提取物诱导成纤维细胞重编程为成骨细胞样细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）成纤维细胞的制备，包括成纤维细胞的分离、鉴定和培养；（2）鱼卵母细胞提取物的制备，包括低温条件下鱼卵母细胞的研磨、过滤和蛋白浓度检测；（3）成纤维细胞的鱼卵母细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱向情，潘兴华，陈强，
申请(专利权)人：陈强，
类型：发明
国别省市：云南,53