核酸分子的构建方法技术

本发明专利技术提供一种单链核酸分子的构建方法，所述单链核酸分子用于利用纳米孔测序仪进行的核酸序列确定，所述单链核酸分子的构建方法包括：使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物和配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序、以及合成的互补链在分子内形成发夹结构并以自身为模板进行延伸反应的工序，得到的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方。通过设为单链结构，能够利用纳米孔测序进行解析，此外仅重复对不含互补链信息的目标核酸序列进行解析，因此能够应对测序错误的问题，同时进行精度更高的解析。

Method for constructing nucleic acid molecule

The present invention provides a method for constructing a single stranded nucleic acid molecules, nucleic acid sequences for using nanopore sequencing instrument to determine the single stranded nucleic acid molecules, including the construction method of the single stranded nucleic acid molecules: complementary chain using 3 'side at least one region containing single stranded hairpin primers and primers with synthesis of template DNA containing target the sequence of the process, and the complementary strand synthesis in the molecule formed within the hairpin structure and its own template extension reaction process, the sequence of nucleic acid molecules containing the target sequence and its complementary strand on both sides. Through a single structure, can use the nanopore sequencing analysis, in addition to not only repeat target nucleic acid sequence containing complementary chain information analysis, it can deal with the problem of sequencing errors, and higher accuracy analysis.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸分子的构建方法
本专利技术涉及用于核酸序列确定的核酸分子的构建方法。更具体而言，涉及适合于利用纳米孔测序进行解析的单链核酸分子的构建方法。
技术介绍
近年来，以遗传性疾病致病基因的检测、药物的有效性、副作用的评价、癌症等相关的基因突变的检测等为目的，核酸碱基序列解析的需求变得非常大。因此，解析结果得到的信息精度必须高。作为高精度读取核酸分子碱基序列的方法，例如，提出了模板核酸片段中核苷酸的共有序列的确定方法，包括将模板核酸片段的正义链和反义链配置于连续核酸分子的阶段，以及通过利用聚合酶进行的依赖模板的测序方法对正义链和反义链双方进行测序的阶段(专利文献1)。专利文献1中记载了“利用模板的环状构成，能够进行同一分子的多次重复测序。换句话说，测序方法沿着完全连续的序列进行，通过重复对来自互补序列的各片段进行测序，可以重复获得该片段的序列数据和各片段内的序列数据。这样的序列数据的全部或一部分在之后衍生模板与其各种片段的共有序列中是有用的。”(段落编号[0055])。此外，专利文献2公开了含有双链核酸区域的、可以为了制作用于序列确定目的的核酸单链构建物而使用的接头。专利文献2中记载了“构本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单链核酸分子的构建方法，所述单链核酸分子用于利用纳米孔测序仪进行的核酸序列确定，所述单链核酸分子的构建方法包括：使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物和配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序，以及合成的互补链在分子内形成发夹结构并以自身为模板进行延伸反应的工序；得到的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.26 JP PCT/JP2015/0555291.一种单链核酸分子的构建方法，所述单链核酸分子用于利用纳米孔测序仪进行的核酸序列确定，所述单链核酸分子的构建方法包括：使用3’侧含有单链区域的至少一个发夹引物和配对的引物合成包含目标序列的模板DNA的互补链的工序，以及合成的互补链在分子内形成发夹结构并以自身为模板进行延伸反应的工序；得到的核酸分子序列中包含目标序列及其互补链双方。2.根据权利要求1所述的方法，所述发夹引物的茎部具有比所述单链部的Tm值高的Tm值。3.根据权利要求1所述的方法，在发夹引物由于反应的进行而减少的同时，合成的互补链序列以自身为模板进行延伸反应。4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用前将发夹引物的5'末端磷酸化，在构建目的核酸分子后使发夹引物5’末端磷酸化的DNA链分解的工序。5.根据权利要求4所述的方法，使用λ外切核酸酶进行所述分解。6.根据权利要求4所述的方法，在5’末端磷酸化的DNA链分解后，从其互补链的3’末端介由发夹结构自身退火进行延伸反应。7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使具有发夹环结构的...

【专利技术属性】
技术研发人员：藤冈满，
申请(专利权)人：株式会社日立高新技术，
类型：发明
国别省市：日本,JP