一种α-氨基酸酯水解酶固定化方法技术

本发明专利技术公开了一种获得固定化α-氨基酸酯水解酶的方法；本发明专利技术所使用的酶来源于含有重组质粒pET28a-aeh的大肠杆菌BL21(DE3)；所使用的载体为含环氧基活性基团的珠状聚合物；固定化酶活力为550-800U/g，固定化酶活回收率达到52%。

【技术实现步骤摘要】
一种α-氨基酸酯水解酶固定化方法
:本专利技术属于生物酶工程
，提供了一种α-氨基酸酯水解酶(AEH)的固定化方法。
技术介绍
:由于游离酶的不稳定性，限制了其在工业上的应用。而将其进行固定化处理后，所得到的固定化酶不但提高了对热、酸碱等的稳定性，而且还使得其能够回收重复使用，从而大大降低工业应用的成本。对于AHl酶的固定化，已经有些报道，其中固定化方法涉及交联聚集体(CLEA)。中国专利申请号200810044881.1报道了一种固定化工艺。该工艺采用红纹黄单胞菌发酵获得菌体，然后采用分步破碎的方式进行细胞破碎，先将菌体于-25'30°C条件下利用低温效应破坏细胞，再用乙酸丁酯处理解冻的悬浮液，用絮凝剂除去细胞残片，离心获得无细胞提取液。向无细胞提取液中加入聚乙二醇沉淀目标蛋白，再加入戊二醛进行交联，制得交联蛋白聚集体形态的固定化α-氨基酸酯水解酶。其中蛋白含量为95%(干重)，合成酶 活力为2200U/g干重。中国专利申请号200910058710.9在此基础上对工艺进行了改进，该工艺同样采用红纹黄单胞菌发酵获得菌体，去除了对菌体进行低温冻融的步骤，而是直接用乙酸丁酯进行细胞破碎，然后加入絮凝剂，离心分离获得高纯度的无细胞提取液，其比活力为5.5-9.5U/mg蛋白。在2_4°C条件下加入分子量为6000-8000的聚乙二醇进行沉淀，再加入25%戊二醛水溶液进行交联，制得无载体固定化的α -氨基酸酯水解酶。其干重含量为21.7%，合成酶活力达到3680U/g干重。上述2种固定化工艺极为相似，后者对前者进行了改进，都属于是无载体固定化形式。所得的固定化酶为酶蛋白交联聚集体，主要缺点有:1、所制得的固定化酶颗粒大小不一，形状各异，不均匀。2、蛋白聚集体颗粒强度低,易碎,不利于工业化应用。3、所得固定化酶为蛋白聚集体，其中蛋白含量占其干重的95%，不易于长时间储存，影响工业化应用。相对于交联聚集体的固定化形式，在载体上固定化的酶更稳定，强度更高，不易破碎，具有更高的循环使用次数。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种α -氨基酸酯水解酶在一种含环氧基活性基团载体上的固定化方法。本专利技术所提供的固定化方法有以下优点:1、所制得的固定化酶颗粒大小均匀，有利于工业化催化反应进行。2、所制得的固定化酶颗粒机械强度高，不易破碎，有利于工业化生产中的反复利用，降低成本。3、所制得的固定化酶由载体表面结合酶蛋白组成，蛋白与载体间以形成共价键方式结合，结合牢固，蛋白不易脱落，具有更高的循环使用次数。4、相对于游离酶和无载体固定化酶，本方法所制得固定化酶易于储存和运输，更有利于工业化应用。本专利技术提供的α -氨基酸酯水解酶固定化方法如下:发酵含有重组质粒pET28a_aeh的大肠杆菌BL21 (DE3)，离心收集菌体，称重。按照4ml/g菌体的添加量，用pH为7.8的缓冲液(含50mmol/lNaH2P04和300mmol/l的NaCl)重悬菌体，搅拌均匀。向上述菌悬液中加入溶菌酶，其终浓度为80000-100000U/ml，间歇搅拌20分钟。之后向其中加入1%的曲拉通X-100，继续搅拌，体系变粘稠。向其中加入DNA酶和RNA酶，添加量分别为10ug/ml和20ug/ml。搅拌I小时，至体系不粘稠。在4°C条件下，8000r/min，离心lOmin。保留离心上清液，为无细胞提取液。于冰水浴中向其中加入硫酸铵至20%饱和度。缓慢搅拌2小时。然后在4°C条件下，9000r/min，离心25min，除去沉淀的杂蛋白，向离心上清液中继续加入硫酸铵至60%饱和度，保持冰水浴条件下缓慢搅拌2小时，沉淀目标蛋白。于4°C条件下，9000r/min，离心30min，所得沉淀为粗酶。活力为2000-3000U/g。 用去离子水将上述得到的粗酶溶解制得粗酶液，备用。配制乙酸钾溶液，用稀氨水调节PH为6.8-7.0备用。用去离子水洗涤含环氧基活性基团的树脂载体，除去悬浮于水面的破碎颗粒，按照QE=400-1000的量加入粗酶液，并向其中加入上述乙酸钾缓冲液，使得乙酸钾的终浓度为0.8-3.0mol/1, α -氨基酸酯水解酶活力为5_100U/ml，控制体系的pH为6.5-7.0,于摇床上100-150r/min转速震摇，摇床温度为10-25°C。振摇2_8小时后取出，用去离子水反复洗涤，至洗出液无酶活力。玻沙漏斗抽滤，得固定化α-氨基酸酯水解酶，活力为550_800U/g干重。本专利技术中所提及的酶活力的定义为:含40 mmol/L 7-ACCA和80mmol/L D-PGM的底物溶液在pH 6.0 (0.05 mo I/L磷酸铵)和30°C条件下反应30min，每分钟生成I μ mo I头孢克洛所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。【具体实施方式】实施例:取170g含有重组质粒pET28a_aeh的大肠杆菌BL21(DE3)菌体。向其中加入680ml pH为7.8的缓冲液(含50mmol/lNaH2P04和300mmol/l的NaCl )，搅拌，形成菌悬液，体积880ml。向其中加入Ig溶菌酶(活力为9650U/mg)，室温下搅拌20分钟，向体系中加Λ 90ml 10%曲拉通X-100溶液，继续搅拌，体系变粘稠状。再向其中加入9.5mg的DNA酶和19mg的RNA酶，继续搅拌I小时。在4°C条件下，8000r/min，离心lOmin。保留离心上清液，为无细胞提取液，体积825ml，活力为168U/ml。于冰水浴中向其中加入87.45g硫酸铵至20%饱和度。缓慢搅拌2小时。然后在4°C条件下，9000r/min，离心25min，除去沉淀的杂蛋白，向离心上清液中继续加入205g硫酸铵至60%饱和度，保持冰水浴条件下缓慢搅拌2小时，沉淀目标蛋白。于4<€条件下,90001'/111；[11,离心30min,得47g粗酶,活力为2423U/g°取26g上述粗酶，用少许去离子水溶解，向其中加入100ml的乙酸钾溶液，用稀氨水调节PH为6.8-7.0，控制乙酸钾的终浓度为1.3mol/l，用1.3mol/l，PH为6.8的乙酸钾溶液调节体系总体积为150ml，用去离子水洗涤载体3次，去除悬浮于水面的破碎颗粒，用玻沙漏斗抽滤，称取105g加入上述酶溶液中。保持固定化反应温度为15°C，摇床转速为150r/min,反应4小时后，取出载体用去离子水洗涤，玻沙漏斗抽干,如此反复4次，至洗涤液无酶活力。称重得 固定化α-氨基酸酯水解酶IlOg,酶活力为713U/g干重，固定化酶活回收率为 52%。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α-氨基酸酯水解酶固定化方法，按如下步骤进行: (O发酵含有重组质粒pET28a-aeh的大肠杆菌BL21 (DE3)，离心分离获得菌体； (2)将菌体用溶菌酶、DNA酶和RNA酶处理，离心分离获得无细胞裂解液； (3)通过盐析初步去除沉淀杂蛋白和沉淀目的蛋白； (4)将所获得粗酶和处理后的载体按照一定的比例加入含有盐的溶液中，控制体系的温度和pH，进行固定化反应，反应一定时间后，取出用去离子水洗涤至洗涤流出液无酶活力，抽滤去水，获得固定化的α-氨基酸酯水解酶。2.如权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，盐析操作中使用的盐为硫酸铵，其质量百分比浓度为从10%-50%。3.如权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，细胞裂解液为大肠杆菌细胞经过溶菌酶处理后经低温高速离心后所得的上清液。4.如权利要求1所述的固定化方法，其特征在于，所使用的载体为含有环氧基活性基团的圆珠状聚合物，其粒径为150 μ m300 μ m,环氧官能团容量不低于50 μ mol/g,含水量 40-70%。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李端华，李进军，叶丽娟，潘佳林，王辂，
申请(专利权)人：中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所，
类型：发明
国别省市：