本发明专利技术涉及动物生物医药工程领域，具体公开了一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。本发明专利技术采用酵母α凝集素表面展示系统来表达PEDV的抗原核心基因COE基因，使COE蛋白锚定在酵母的细胞壁上，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。该重组毕赤酵母可制备成具有良好产业化前景的新型疫苗产品，随着这些疫苗的推广应用，对养猪业危害严重的病毒性腹泻的预防起到积极的作用，对保护和促进养猪业健康发展具有重要的实践意义，同时亦将取得显著的社会经济效益，拥有广大的市场并具备产业化的前景。
【技术实现步骤摘要】
—种表面展示PEDV核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法
本专利技术涉及动物生物医药工程领域，特别是一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。
技术介绍
自2010年10月份以来，仔猪腹泻病的发生与流行在国内主要养猪省份均呈持续上升趋势，也是引起7日龄以内仔猪死亡的重要原因，短短一年多，以广东省为首的南方10个省市仔猪死亡量超过了 100万头，发病率为60%-100%，死亡率高达80%-100%，严重威胁着养猪业的健康发展，造成了巨大的经济损失。猪流行性腹?写病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)是国内外学者较为认同的主要致病因素之一。目前防止猪病毒性腹泻的最为有效的手段是接种疫苗。虽然国内用于流行性腹泻的疫苗主要有:PEDV与TGEV二联疫苗(包括二联灭活苗及二联活疫苗)得到了广泛的推广和应用，在一定范围和程度上减少了病毒性腹泻的发病率，但仍然未能完全控制，尤其在2010年10月至今，该病呈持续性、爆发性增长趋势。从目前国内外对PEDV、TGEV和RV的研究结果及应用效果看，仔猪主要通过初乳获得母源slgA，产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护，血清中的循环抗体IgG不能提供保护，经非肠道免疫不能产生母源免疫。因此，迫切需要研制出安全、有效、廉价并且可以诱导黏膜免疫的新型PEDV 口服疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了克服现有技术中PEDV疫苗存在的上述缺陷，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的: 一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法，以α凝集素作为靶基因将COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，具体方法如下: 51.pPICZ a A-COE-AGa重组质粒的制备:将凝集素AGa基因片段和pPICZ a载体通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-AGa ;将COE基因片段和重组质粒pPICZ a A-AGa通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-COE-AG a ;所述凝集素AG a基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO:广2所示； 52.采用电转化法将pPICZa A-COE 一 AG a重组质粒导入毕赤酵母X33中，获得重组酵母 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG a。优选地，S2所述电转化法为:取80 μ L毕赤酵母感受态细胞，与5~10 μ g线性化的重组质粒pPICZ a A-COE-AG a混合，冰浴15min，在电压1500V，电容量25 μ F，电阻200 Ω条件下电击，电击后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇，30°C下孵育I~2小时，平板筛选高拷贝转化子。优选地，凝集素AG a基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO:3~4所示，COE基因片段的扩增用引物序列如SEQ ID NO:5~6所示。由以上方法制备得到的重组酵母PicAiaX-33/pPICZ a A-COE-AG α。所述重组酵母pastor I s X-33/pPICZ a A-COE-AG α在制备预防猪流行性腹泻口服疫苗中的应用。一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，包括如下步骤: 51.将重组酵母PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG α 接种于 YPD 液体中，30°C >250 r/min振荡培养过夜；再接种于BMGY体培养基中，30°C振荡培养24 h，至菌体OD6tltol达到2~6时离心弃去上清，加入BMMY液体培养基，连续诱导培养72 h ； 52.离心去上清，将菌体用用悬浮缓冲液稀释得到细菌含量为IXIOkiCFU/mL的菌悬液，菌悬液再制备成口服疫苗，直接灌喂；所述悬浮缓冲液组成为:0.2 mol/L NaHCO3, 5%水解酪蛋白，0.5%葡萄糖悬浮。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果: 本专利技术采用酵母α凝集素(a-agglutinin)表面展示系统来表达PEDV的抗原核心基因COE基因，并使COE蛋白锚定在酵母的细胞壁上，提供一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法。本专利技术同时使用其他类型的酵母锚定蛋白来使COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，但是结果发现使用α凝集素作为PEDV抗原核心基因COE的锚定蛋白，可以较牢固地将COE锚定在细胞表面，不会轻易地从细胞表面脱落，而且α凝集素可以与COE蛋白序列的C端有效融合而不影响COE蛋白的结构和功能。而使用其他的锚定蛋白，效果都不好，如a凝集素。a凝集素包括由AGAl编码的核心亚基和由AGA2编码的小结合亚基组成，亚基之间通过二硫桥相连，将COE蛋白的N端或C端展示在酵母表面，容易从酵母细胞壁上脱落，泄露到培养基中。作为一种真核表达系统，酵母表面展示系统具有以下优点:(I)、展示的蛋白具有天然构象；(2)1个细胞中可以展示来自于I种或多种致病细菌的抗原蛋白质；(3)安全，表达的外源蛋白无需经过纯化，可以连同菌体一起服用。目前国内外还未见将酵母展示技术用于展示猪流行性腹泻病毒的核心抗原COE蛋白。本专利技术与市场已有疫苗相比，在肠黏膜、粪便、泪液中产生SlgA数量及抗体维持时间上有优势；酵母属于真核表达系统，表达出来的重组蛋白更接近于天然蛋白，有利于重组COE蛋白活性的保持；更加安全、廉价，适合于在畜牧生产中进行应用。【专利附图】【附图说明】图1.重组载体pPICZ a A-COE-AG α双酶切鉴定鉴定结果；Μ.DL2000 DNAMarker ； 1.pPICZ a A-COE-AG a EcoR I ,Kpn I 双酶切鉴定。图2.重组毕赤酵母PicAiaX-33/pPICZ a A-COE-AG a PCR鉴定结果；M.DL2000 Marker; 1.重组毕赤酵母AGa PCR鉴定；2.AGa阳性对照；3.重组毕赤酵母COE PCR鉴定；4.COE阳性对照。图3.重组 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG a 的诱导表达结果；M.蛋白 marker 1.Pichia pas tor is X-33 空白对照；2.Pichia pas tor is X-33/pPICZ a A 空白对照；3.2%甲醇诱导重组酵母表达96h ；4.3%甲醇诱导重组酵母表达96h。图4.毕赤酵母细胞壁蛋白免疫印迹；1.PicAia pas tor is X-33细胞壁蛋白免疫印迹(空白对照)；2.paWoris X-33/pPICZ a A细胞壁蛋白免疫印迹(空白对照)；3.3%甲醇诱导重组酵母细胞壁蛋白免疫印迹。图5.重组 PicAia pas tor is X-33/pPICZ a A-COE-AG α 的显微镜免疫荧光检测。【具体实施方式】下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本专利技术。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、设备为本
常规试剂和设备。实施例1 S1.α凝集素表面展示型重组质粒pPICZ a A- C本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种表面展示猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，以α凝集素作为靶基因将COE蛋白锚定在酵母细胞壁上，具体方法如下: .51.pPICZ a A-COE-AGa重组质粒的制备:将凝集素AGa基因片段和pPICZ a载体通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-AGa ;将COE基因片段和重组质粒pPICZ a A-AGa通过酶切、连接技术构建得到重组质粒pPICZ a A-COE-AG a ;所述凝集素AG a基因片段和COE基因片段的序列如SEQ IDNO:广2所示； .52.采用电转化法将pPICZa A-COE 一 AG a重组质粒导入毕赤酵母X33中，获得重组酵母 PicAia X-33/pPICZ a A-COE-AG a。2.根据权利要求1所述重组毕赤酵母菌的制备方法，其特征在于，S2所述电转化法为:取80 μ L毕赤酵母感受态细胞，与5~10 μ g线性化的重组质粒pPICZ a A-COE-AG a混合，冰浴15min，在电压1500V，电容量25 μ F，电阻200 Ω条件下电击，电击后立即加入ImL冰浴的lmol/L山梨糖醇，30°C下孵育1~2小时，平板筛选高拷贝转化子。3.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，袁尧，胡文锋，李智丽，曾喜多，孙宝丽，毕英佐，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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