一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体公开了一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法。本发明专利技术通过将鼠的解偶联蛋白1基因转到猪的基因组中，获得了一种既能抵抗寒冷又能通过脂肪沉积减少来提高瘦肉率的转基因猪。本发明专利技术通过定点单基因的操纵，同时改善猪两个重要生产性状，不仅为大动物基因编辑的应用及其基础研究打下基础，也为育种工作者对家畜进行性状改良带来新的思路。

Cold resistant and lean lean transgenic pig and preparation method thereof

The invention relates to the field of gene engineering, in particular to a cold resistant and lean lean transgenic pig and a preparation method thereof. By transferring the uncoupling protein 1 gene of the mouse to the pig genome, the invention obtains a transgenic pig capable of resisting cold and improving lean meat rate by reducing the accumulation of fat. The present invention by manipulating the fixed-point single gene, while improving the pig two important production traits, not only lay the foundation for the application and basic research of animal gene editing, also for the breeders of livestock traits improvement brings new ideas.

【技术实现步骤摘要】
一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法。
技术介绍
在猪的现代育种工作中，减少脂肪过度沉积，增加瘦肉率，提高饲料转化效率是育种工作者一直致力解决的问题。在我国也有较多的脂肪型地方品种，如广西陆川猪，太湖猪等，均需要改良以提高瘦肉率及饲料转化率。目前猪的重要经济性状的改良主要依赖遗传育种的方法。育种工作已经经历了依赖数量遗传学的常规选育到依赖基因组学和分子生物学的分子标记辅助选择(MAS)和基因型或数量性状位点(QTL)直接选择。虽然常规的选育方法已经在猪生产性状改良上取得了很大的进展，但这一过程需要测定技术和育种方法具有相当的科学性和准确性及可行性，并需要大量人力物力的投入，而且育种周期长。分子育种也面临很大的难题，尤其是面对那些低遗传力的数量性状，鉴定性状相关基因往往要很长时间，花费较高成本，而且许多研究最终都只停留在目标基因的定位上，未进一步走向育种应用。我国多数瘦肉型商品猪生产的主要途径，大多采用引入外来优良猪种与本地猪种进行杂交获得二元杂种的方法，如直接从国外原产地引进的丹麦长白、英国大约克、美国杜洛克和汉普夏等世界著名瘦肉型猪种，虽然培育出了一批瘦肉型猪新品种(系)，然而，世界一流的品种和育种技术是买不到的，“拿来主义”只能导致我们陷入“引种→退化→再引种→再退化”的被动局面，更不可能使我国畜牧业生产水平与世界发达国家展开真正的竞争。不仅如此，新出生仔猪的颤抖性产热能力仍不健全，会因较差的产热能力而降低存活率，现代养殖场中，都采用保温灯对仔猪进行保暖以提高存活率。然而，保温灯的使用无疑增加了生产成本，而对一些寒冷地区却没有配备保温灯的养殖户来说，仔猪存活率势必要受到天气寒冷的影响。因此，亟需提供一种方法能够既提高猪的瘦肉率及饲料转化率，又能提高猪的抗寒能力。有研究发现，解偶联蛋白1(UCP1)是一种在棕色脂肪里特异表达，存在于线粒体内膜上的一种蛋白，它能消除线粒体内膜两侧因呼吸链的电子传递而建立的质子浓度差，使这种电化学浓度势能以热量的形式散发，这种产热也被称为非颤抖性产热。然而，猪并不含有棕色脂肪(Jastroch,M.,&Andersson,L.Whenpigsfly,UCP1makesheat.MolecularMetabolism,4(5),359-362.doi:10.1016/j.molmet.2015.02.005)。因此，尚未见到将该基因应用在猪的改良方面的任何报道。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种抗寒及瘦肉型转基因猪，其为在脂肪组织中过表达UCP1基因的转基因猪。所述UCP1基因可选自任意物种有功能的UCP1基因，如人、牛、羊、小鼠等动物。进一步地，所述UCP1基因为来自鼠的解偶联蛋白1基因，由脂联素启动子特异性启动过表达。作为优选，所述脂联素启动子为鼠源的脂联素启动子。本专利技术供体质粒中的UCP1基因和启动子，由表达载体Pcdna3.1酶切得到，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。第二方面，本专利技术还提供了前述转基因猪的制备方法，包括如下步骤：S1、构建含有靶标序列、脂联素启动子和UCP1基因的供体质粒；S2、构建针对靶标序列的Cas9/gRNA载体；S3、将构建好的供体质粒和Cas9/gRNA载体对猪胎儿成纤维细胞进行共转染，通过有限稀释法获得单克隆细胞，进一步通过PCR鉴定获得打靶成功的阳性细胞；S4、将筛选得到的阳性克隆细胞作为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术进行体细胞克隆，获得转基因猪。所述供体质粒的出发载体可为本领域常规使用的载体，在本专利技术的一个具体实施方式中，选择pLB载体作为出发载体。所述供体质粒中的靶标序列位于启动子序列前，UCP1基因位于启动子序列后。所述靶标序列采用麻省理工学院的ZhangFeng教授开发的在线工具CRISPRDesignTool(http://crispr.mit.edu/)来设计并交由ThermoFisher公司合成，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，在猪基因组中位于猪解偶联蛋白1假基因的2号外显子。所述Cas9/gRNA载体按照本领域常规技术手段制备。包含Cas9的PX330质粒购买自Addgene。首先用BbsⅠ内切酶切割PX330质粒，纯化回收线性化的质粒。接着将gRNA识别序列(即前述的靶标序列)进行变性复性处理，使其由单链核苷酸变成双链寡核苷酸，再用T4DNA连接酶将双链DNA与线性化的PX330质粒进行连接。转化，涂板，摇菌，进一步测序鉴定阳性菌液，大提质粒备用。第三方面，本专利技术提供了前述方法在提高转基因猪抗寒能力、和/或提高转基因猪瘦肉率，和/或提高转基因猪饲料转化率方面的应用。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过将鼠的解偶联蛋白1基因转到猪的基因组中获得抵抗寒冷刺激和脂肪沉积减少瘦肉率增加的转基因猪。本专利技术提供了一种既能抵抗寒冷又能通过脂肪沉积减少来提高瘦肉率的转基因猪。本专利技术通过定点单基因的操纵，同时改善猪两个重要生产性状，不仅为大动物基因编辑的应用及其基础研究打下基础，也为育种工作者对家畜进行性状改良带来新的思路。附图说明图1为本专利技术打靶载体构建及基因敲入鉴定策略。图2为本专利技术阳性打靶细胞鉴定。图3为本专利技术转基因猪基因型鉴定。图4为本专利技术冷冻条件下猪只肛温变化。图5为本专利技术冷冻条件下猪只红外照片及体表温度显示。图6为本专利技术野生型和转基因猪的屠宰指标检测。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。鼠脂联素启动子启动的解偶联蛋白1表达载体Pcdna3.1由中国科学院动物研究所金万洙馈赠。序列测定和引物合成由ThermoFisher公司完成。Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均购自北京NEB公司，体细胞核移植所用试剂均购自Sigma公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤参照《分子克隆(第三版)》。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1转基因猪的制备按照图1所述的策略进行打靶载体的构建及外源基因的敲入。1、Cas9/gRNA打靶载体的构建gRNA的识别序列采用麻省理工学院的ZhangFeng教授开发的在线工具CRISPRDesignTool(http://crispr.mit.edu/)来设计并交由ThermoFisher公司合成，该序列位于猪解偶联蛋白1假基因的2号外显子。包含Cas9的PX330质粒购买自Addgene。首先用BbsⅠ内切酶切割PX330质粒，纯化回收线性化的质粒。接着本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗寒及瘦肉型转基因猪，其特征在于，其为在脂肪组织中过表达UCP1基因的转基因猪。

【技术特征摘要】
1.一种抗寒及瘦肉型转基因猪，其特征在于，其为在脂肪组织中过表达UCP1基因的转基因猪。2.根据权利要求1所述的转基因猪，其特征在于，所述UCP1基因为来自鼠的解偶联蛋白1基因。3.根据权利要求1或2所述的转基因猪，其特征在于，所述UCP1基因由脂联素启动子特异性启动过表达。4.根据权利要求3所述的转基因猪，其特征在于，所述脂联素启动子为鼠源的脂联素启动子。5.权利要求1～4任一项所述的转基因猪的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、构建含有靶标序列、脂联素启动子和UCP1基因的供体质粒；S2、构建针对靶标序列的Cas9/gRNA载体；S3、将构建好的供体质粒和Cas9/gRNA载体对猪胎...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵建国，郑千涛，黄娇娇，秦国嵩，金万洙，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11