一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法技术

本发明专利技术涉及一种一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法。一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还涉及利用上述特异引物检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的方法。本发明专利技术基于一步法实时荧光RT‑PCR检测番茄褪绿病毒的方法直接检测样品RNA中携毒情况，省略“反转录合成第一链cDNA”这一步骤，检测灵敏度高并且检测所用时间少，从样品RNA提取至检测完毕仅需2h，适用于样本量较少的单头媒介昆虫的病毒检测。

One step real-time RT detection PCR single head of B.tabaci in tomato chlorotic and green virus specific primer method

The present invention relates to a method of specific primers and a one-step real-time fluorescence RT detection PCR single head of Bemisia tabaci in tomato chlorosis virus. One step real-time RT detection PCR single head of Bemisia tabaci in tomato chlorotic green virus specific primers, the specific primers for the upstream primer nucleotide sequence of SEQ ID NO.1, nucleotide sequence and downstream primers as shown in SEQ ID NO.2. The invention also relates to a method for detecting a tomato chlorosis virus in a single whitefly using the specific primers. The method of the invention is one-step real-time fluorescence RT detection of tomato chlorosis virus PCR based on direct detection of toxic sample RNA, this step is omitted \reverse transcription to synthesize the first strand cDNA, high detection sensitivity and detection with less time, completed only 2H samples from RNA extraction to detection, virus detection for samples less amount of single head insect vectors.

【技术实现步骤摘要】
一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法
本专利技术涉及一种一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物及方法，属于蔬菜病毒检测

技术介绍
植物病毒是植物的“癌症”，其流行依赖于载体的传播扩散，其中近80％的植物病毒通过特定的媒介昆虫进行传播，且以半翅目的刺吸式口器昆虫居多，例如蚜虫、粉虱、飞虱、木虱、叶蝉等。随着全球气候变暖，以及经济贸易往来频繁，外来生物入侵加剧，植物病毒病的发生也日趋严重，由褐飞虱(Nilaparvatalugens)传播的水稻矮缩病毒病和由烟粉虱(Bemisiatabaci)传播的番茄黄化曲叶病毒病在世界范围内流行。近年来一种新入侵的植物病毒，番茄褪绿病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)传入我国内陆地区，该病毒可以侵染番茄、辣椒、甜椒、烟草等多种作物，侵入植株后，导致叶脉间发黄褪绿，边缘卷曲变脆，阻碍植株正常生长发育，造成果实减产。最新监测结果表明，ToCV在我国呈快速蔓延态势，目前已成功扩散至北京、天津、内蒙古、山东、山西和浙江等地。该病毒不能通过摩擦等方式接种，仅能够通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一步法实时荧光RT‑PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一步法实时荧光PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取单头烟粉虱的总RNA；(2)制备ToCV标准品，并按梯度稀释成不同浓度，制备标准曲线；(3)以步骤(1)制备的单头烟粉虱的总RNA，通过一步法实时荧光RT-PCR进行ToCV的检测，结合检测得到的扩增曲线、熔解曲线判断待检样品是否含有该病毒，并根据检测得到的Ct值，代入步骤(2)制备得到的标准曲线计算待检样品所含有的病毒量。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取单头烟粉虱的总RNA，步骤如下：1)取一头待检测烟粉虱，放入去除RNase的1.5mL离心管底部，将离心管置入液氮中冷冻5s后取出，用无RNase的研磨棒进行研磨，将烟粉虱研磨成粉末后，加入400～500μLTrizol，充分震荡混匀后，室温静置10min；2)加入80～100μL氯仿，震荡混匀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，取上清；3)在上清液中加入200～250μL异丙醇，充分混匀后，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；4)加入400～500μL体积浓度75％的乙醇溶液，充分洗涤沉淀后，静置10min，12600rpm、4℃离心15min，弃上清；5)静置，待离心管中沉淀周围的体积浓度75％的乙醇溶液充分挥发后，加入8～10μLRNase-Freewater，沉淀溶解后，即得到单头烟粉虱的总RNA。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，制备ToCV标准品和标准曲线步骤如下：1)以ToCV感染的番茄植株cDNA作为模板，用一步法实时荧光RT-PCR检测单头烟粉虱体内番茄褪绿病毒的特异引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μL、dNTPMixture2μL、上游引物和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、rTaq0.25μL、ddH2O17.25μL；PCR反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃后延伸10min，置于4℃保存；2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁天波，褚栋，于建美，高嘉健，徐圣，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37