一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域的一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法。该方法包括以下步骤：A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；其中，反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白‑蛋白酶的识别位点‑受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液。本发明专利技术所述筛选方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联，显著提高了检测的灵敏度；同时该方法可利用荧光酶标仪和96微孔板实现溶菌酶的高通量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法。
技术介绍
溶菌酶(lysozyme，EC3.2.1.17)又称胞壁质酶(muramidase)，能特异性水解原核细菌细胞壁中的主要成分肽聚糖，分解微生物的细胞壁，使细菌失去细胞壁的保护并在胞内高渗透压的作用下破裂死亡，从而达到杀菌目的。1921年，著名英国细菌学家AlexanderFleming在人的鼻液中发现了溶菌酶，后证实溶菌酶广泛存在于鸟类和禽类的蛋清内、哺乳动物的各器官组织和体液内、植物以及软体动物和昆虫体内。溶菌酶作为高等有机体组织及体液中最强大的抗菌剂之一，是生物机体对抗外源病原菌侵袭的重要防御因子。如人溶菌酶是一种小分子碱性球蛋白，它由上皮细胞和单核-巨噬细胞分泌，可识别和破坏病原菌的细胞结构，并通过信号级联反应吸引白细胞集中到感染部位，最终消灭侵染人体的病原菌。此外，溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，和DNA-RNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。在植物中，如无花果的鲜汁中均含有丰富的溶菌酶，推测其与植物的抗病毒作用密切关系。另一方面，溶菌酶也广泛存在于微生物中，如各种细菌和噬菌体。噬菌体溶菌酶与噬菌体侵染过程中细菌细胞壁的分解有关。细菌溶菌酶的主要功能是参与细胞生长分裂形态改变等与细胞壁相关的代谢过程。因此，细菌不会对溶菌酶这种细菌中广泛含有的自溶素(autolysin)，产生真正意义上的抵抗性，这对于解决日益严峻的细菌耐药性问题，减少抗生素滥用具有重要意义。虽然溶菌酶的作用强大，但其对革兰氏阴性菌的裂解效果并不好。这是由于细菌细胞壁构成不同所导致的。革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖构成，肽聚糖层数较多且较厚，含有少量磷壁酸，而革兰氏阴性菌外层主要由脂多糖(LPS)构成，内层才含有少量肽聚糖。而溶菌酶的主要作用位点为细胞壁中的肽聚糖，水解β-1,4糖苷键，故其对于革兰氏阴性菌的作用效果不是很理想。在日常生活当中，人们所接触到的很多致病菌，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎杆菌、痢疾杆菌和产气荚膜杆菌等，都属于革兰氏阴性菌。为了得到对革兰氏阴性菌具有高杀菌活性的溶菌酶，可以对溶菌酶进行定向进化，构建溶菌酶基因随机突变文库，再从中筛选出对革兰氏阴性菌杀菌效果较强的溶菌酶。定向转化过程中，一方面，所需的突变体文库数量庞大，需采用高通量方法以提高筛选效率；另一方面，溶菌酶对革兰氏阴性菌裂解效果差，需采用衡量指标较敏感、可有效反映裂解效果的筛选手段。而现有的筛选方法如平板抑菌圈法、牛津杯法等，无法很好的同时满足以上两点要求。因此，亟需构建一种灵敏可靠、易操作的高通量筛选方法，用于新型广谱溶菌酶突变体的筛选。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法，该方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联使用，提高了检测的灵敏性，同时利用荧光酶标仪和96微孔板可以实现溶菌酶的高通量检测。为此，本专利技术提供了一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法，其包括以下步骤：A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；其中，所述反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白-蛋白酶的识别位点-受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液。在本专利技术中，根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，判断发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性；具体地，反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长越快，发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性越高。在本专利技术的一些实施方式中，所述的蛋白酶为具有识别序列特异性的蛋白酶；在本专利技术的一些具体实施例中，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶、肠激酶或凝血因子Xa；在本专利技术的一些优选的实施例中，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶。在本专利技术的另一些实施方式中，所述TEV蛋白酶的识别位点的氨基酸序列为：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly。在本专利技术的一些实施方式中，所述目标溶菌酶基因突变文库的构建方法为易错PCR和/或DNA改组。在本专利技术中，由于供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的吸收光谱重叠，因此当供体荧光蛋白与受体荧光蛋白之间的距离在10nm以内时，会发生能量转移现象，供体荧光蛋白的能量转移至受体荧光蛋白上，使供体蛋白荧光强度要比它单独存在时低得多，而受体蛋白荧光强度大大增强。在本专利技术的一些具体实施例中，所述的供体荧光蛋白为青色荧光蛋白，所述的受体荧光蛋白为黄色荧光蛋白。在本专利技术的一些具体实施方式中，所述真核细胞为毕赤酵母。在本专利技术的另一些具体实施方式中，所述方法还包括以下步骤：C，对筛选出的对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶进行复筛，根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，验证溶菌酶的活性。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述筛选方法通过FRET荧光蛋白对与位点特异性蛋白酶的级联，借助检测荧光信号，显著提高了检测的灵敏度，可有效地发现阳性突变，找到优良突变基因；同时该方法可利用荧光酶标仪和96微孔板实现溶菌酶的高通量检测。具体实施方式为使本专利技术容易理解，下面将详细说明本专利技术。本专利技术所述筛选方法基于荧光共振能量转移技术(FRET)，即两个荧光蛋白分子距离极近(10nm以内)时，如果供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的吸收光谱重叠，则会发生能量转移现象，供体荧光蛋白的能量转移至受体荧光蛋白上，使供体蛋白荧光强度要比它单独存在时低得多，而受体蛋白荧光强度大大增强。以青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白为例，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白是一对可以发生FRET效应的蛋白，其中青色蛋白的发射光谱与黄色蛋白的吸收光谱重叠。用蛋白酶的识别位点作为linker序列，例如，采用TEV蛋白酶的识别位点作为linker序列将青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白连接，使青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白形成距离极近的FRET荧光蛋白对，即“青色荧光蛋白-TEV蛋白酶的识别位点-黄色荧光蛋白”。TEV蛋白酶的识别位点是由Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly七个氨基酸构成。反应前，由于linker序列(TEV蛋白酶的识别位点)的作用，青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白距离极近，青色荧光蛋白的能量转移至黄色荧光蛋白上，此时检测信号呈现青色荧光信号弱、黄色荧光信号强；当将含溶菌酶的发酵液加入反应液中，若溶菌酶对底物菌种(革兰氏阴性菌)有较好的杀菌活性，则细菌发生裂解并释放内部的FRET荧光蛋白对。该蛋白对的TEV蛋白酶的识别位点被反应液中的TEV蛋白酶特异性识别并分解，得到独立的青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白，FRET现象消失，使得青色荧光信号增强。因此，可以通过定量测定青色荧光蛋白信号强度的增长速度，来判定溶菌酶对革兰氏阴性菌的杀菌活性。本专利技术所涉及的新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法的具体操作如下：(1)构建表达目标溶菌酶基因突变文库的真核细胞：目标溶菌酶的具体种类可根据实际需要选择。编码目标溶菌酶的基因序列通过核酸数据库查找并进行全基因合成，得到原始目标溶菌酶基因序列。构建目标溶菌酶基因随机突变文库主要通过易错PCR和DNA改本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法，其包括以下步骤：A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；其中，所述反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白‑蛋白酶的识别位点‑受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种新型广谱溶菌酶的高通量筛选方法，其包括以下步骤：A，将目标溶菌酶的基因突变文库在真核细胞中进行分泌表达，获得含不同活性目标溶菌酶的发酵液；B，将含不同活性目标溶菌酶的发酵液分别加入到反应体系中进行反应，筛选出对革兰氏阴性菌杀菌活性高的溶菌酶；其中，所述反应体系包括：胞内表达“供体荧光蛋白-蛋白酶的识别位点-受体荧光蛋白”的革兰氏阴性菌、蛋白酶和蛋白酶反应缓冲液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据反应过程中供体荧光蛋白的信号强度增长速度，判断发酵液中的溶菌酶对革兰氏阴性菌杀菌活性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为具有识别序列特异性的蛋白酶。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶、肠激酶或凝血因子Xa；优选地，所述的蛋白酶为TEV蛋白酶。5.根据权利要求4所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：温赛，刘怀然，茅同心，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京,11