密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法技术

本发明专利技术适用于生物光子学技术领域，提供了一种密封重水方法，在重水表面滴石蜡油，使其覆盖在所述重水表面；本发明专利技术还提供了一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法，包括：在装有待测样品的玻片上滴重水，所述装有待测样品的玻片置于多光子成像系统中；滴石蜡油在所述重水上，使其覆盖在所述重水表面；所述多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，产生多光子信号，并利用所述多光子成像系统中的探测器收集所述多光子信号；基于收集到的多光子信号检测多光子信号强度，并判断多光子信号强度的变化是否在阈值范围内。本发明专利技术提供的检测方法，因为石蜡油对重水有很好的密封效果，从而使产生的多光子信号强度没有随着时间的增加而发生衰减。

【技术实现步骤摘要】
密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法
本专利技术属于生物光子学
，尤其涉及一种密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法。
技术介绍
多光子显微成像是一种基于非线性光学效应的成像技术，它在生物医学方面有着十分广泛的应用。多光子成像有两个主要的研究方向，一是保证不损伤生物组织的前提下提高成像深度，二是扩展成像模态从而得到更多样品信息。这两个方向的研究都得益于激光的发展。近来，已经有实验展示了采用1700nm波段高能量孤子激光作为激发光源，通过多光子成像技术可以对活体小鼠的深层脑部组织进行成像，1700nm波段激发的多光子成像是一种能够显著提高组织成像深度和扩展多光子成像模态的显微成像技术。此外，在1700nm波段，二次谐波成像，三光子荧光成像，三次谐波成像，四光子荧光成像[8]，四次谐波成像以及五光子荧光成像都在实验上已有演示。因此，1700nm波段多光子成像极具应用前景。多光子成像中，一个必不可少的光学元件是高数值孔径的浸润物镜。实验中，浸润介质通常是用来匹配样品组织的折射率以减少成像过程中产生的像差。在对小鼠脑部成像时，一般使用纯水浸润，而在对皮肤组织成像时一般使用油浸润。实验结果表明，尽管成像过程中，浸润介质的厚度很薄(毫米量级)，但它对1700nm波段的吸收是不可忽视的。鉴于产生信号对激发功率的非线性依赖关系，它会导致多光子信号的大幅衰减。所以我们提出了以重水代替纯水浸润的方法，并且在使用油浸润时会谨慎选择激光波长。目前，在1700nm波段的小鼠脑组织深层成像只能通过重水浸润得到。尽管重水的吸收系数与水相比小了1个数量级[5]，但由于重水的吸水性使得重水在实验过程中会从周围环境吸收水蒸汽，使得它的透过率会随时间而降低，从而导致到达样品上的激发光和多光子信号强度会随着实验时间增加而衰减。这十分不利于基于荧光强度探测的时间动力学测量，比如荧光分子的漂白特性研究和生物样品中荧光分子的标记和清除检测。为了避免重水的吸水性，最容易想到的方法就是在实验中不断更换重水。然而，这个方法有几个缺点：(1)在更换新的重水之前，必须将先前被水蒸汽污染过的重水小心、完全地移除，保证没有残留。(2)在持续时间较长的成像过程中，比如小鼠大脑的多光子成像(可能会持续5个小时)需要在实验中更换将近9次重水，因为三光子信号经过35分钟后强度会衰减为原来的一半。尽管如此，基于荧光强度的时间动力学测量也不能采用这种方法，因为重水吸收水蒸汽导致信号的衰减会叠加到荧光染料的衰减曲线里，使得实验结果产生误差。那么，需要提供一种合适的重水密封方法，从而避免因重水的吸水性而导致多光子成像过程中产生的多光子信号强度随时间的增加而衰减。
技术实现思路
本专利技术提供一种密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法，旨在在多光子成像中利用石蜡油密封重水，并通过检测多光子信号强度是否发生变化来判断用石蜡油密封重水的效果。本专利技术提供了一种密封重水方法，在重水表面滴石蜡油，使其覆盖在所述重水表面。进一步地，所述石蜡油的用量和所述重水的用量相等。本专利技术还提供了一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法，所述方法包括：在装有待测样品的玻片上滴重水，所述装有待测样品的玻片置于多光子成像系统中；滴石蜡油在所述重水上，使其覆盖在所述重水表面；所述多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，产生多光子信号，利用所述多光子成像系统中的带通滤光片滤除特定波长的光信号，使所述待测样品产生的多光子信号透过，并利用所述多光子成像系统中的探测器收集所述多光子信号；基于收集到的所述多光子信号检测所述多光子信号强度，并判断所述多光子信号强度的变化是否在阈值范围内。进一步地，所述装有待测样品的玻片上固定有橡胶环，所述重水滴在所述橡胶环的环内，防止所述重水扩散；所述橡胶环的外径为22mm，内径为15.8mm，厚度为3.1mm。进一步地，所述待测样品为荧光染料，所述多光子信号为三光子荧光信号；所述带通滤光片为第一带通滤光片，用于滤除特定波长的光信号，使所述荧光染料产生的三光子荧光信号透过；所述探测器为镓砷磷探测器，用于收集所述三光子荧光信号。进一步地，所述待测样品为小鼠脑部白质，所述多光子信号为三次谐波信号；所述带通滤光片为第二带通滤光片，用于滤除特定波长的光信号，使所述小鼠脑部白质产生的三次谐波信号透过；所述探测器为砷化镓探测器，用于收集所述三次谐波信号。进一步地，所述多光子成像系统沿光路方向包括：飞秒激光器、光子晶体棒、长波通滤光片、多光子显微镜，所述待测样品置于所述多光子显微镜下；所述飞秒激光器用于产生1550nm飞秒激光脉冲，所述光子晶体棒用于根据耦合入的所述飞秒激光脉冲产生1665nm孤子脉冲，所述长波通滤光片用于滤出1665nm孤子脉冲，并以所述1665nm孤子脉冲作为激发光，所述多光子显微镜用于使所述激发光照射到所述待测样品上，并对所述待测样品进行成像。进一步地，所述多光子显微镜沿光路方向包括：扫描振镜、扫描透镜、套筒透镜以及水浸物镜。进一步地，所述多光子成像系统还包括第一透镜、第二透镜和反射镜，所述第一透镜设置于所述飞秒激光器和所述光子晶体棒之间，用于聚焦所述飞秒激光器产生的1550nm飞秒激光脉冲，并耦合入所述光子晶体棒；所述第二透镜和所述反射镜设置于所述光子晶体棒和所述长波通滤光片之间，所述第二透镜用于准直所述光子晶体棒产生的1665nm孤子脉冲，所述反射镜用于将准直后的1665nm孤子脉冲反射入所述长波通滤光片。本专利技术与现有技术相比，有益效果在于：本专利技术提供了一种密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法，在装有待测样品的玻片上滴重水，并用石蜡油覆盖在所述重水上，利用多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，从而产生多光子信号，利用探测器收集所述多光子信号，并基于收集到的所述多光子信号检测所述多光子信号强度；通过判断所述多光子信号强度的变化是否在阈值范围内，来判断石蜡油密封重水的效果；本专利技术提供的检测多光子成像中多光子信号强度的方法，因为石蜡油对重水有很好的密封效果，重水在检测过程中没有吸收水蒸汽，从而使产生的多光子信号强度没有随着时间的增加而发生衰减；另外，也有利于基于荧光强度探测的时间动力学测量。附图说明图1是本专利技术实施例提供的固定有橡胶环的玻片的示意图；图2是本专利技术实施例提供的一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法；图3是本专利技术实施例提供的多光子成像系统中的硬件结构示意图；图4是本专利技术实施例提供的随时间衰减的SR101三光子荧光信号(左列)和小鼠脑部白质的三次谐波信号(右列)的示意图；；图5是本专利技术实施例提供的没有密封重水的三光子荧光信号(红圈)和三次谐波信号(绿色方块)随时间衰减的变化曲线；图6是本专利技术实施例提供的随时间衰减的荧光染料SR101三光子荧光信号(左列)和小鼠脑部白质的三次谐波信号(右列)的示意图；图7是本专利技术实施例提供的归一化后的三光子荧光信号随时间变化的关系。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术采用了一种简单并且非常有效的方法将重水与水蒸汽隔绝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种密封重水方法，其特征在于，在重水表面滴石蜡油，使其覆盖在所述重水表面。

【技术特征摘要】
1.一种密封重水方法，其特征在于，在重水表面滴石蜡油，使其覆盖在所述重水表面。2.如权利1所述的密封重水方法，其特征在于，所述石蜡油的用量和所述重水的用量相等。3.一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法，其特征在于，所述方法包括：在装有待测样品的玻片上滴重水，所述装有待测样品的玻片置于多光子成像系统中；滴石蜡油在所述重水上，使其覆盖在所述重水表面；所述多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，产生多光子信号，利用所述多光子成像系统中的带通滤光片滤除特定波长的光信号，使所述待测样品产生的多光子信号透过，并利用所述多光子成像系统中的探测器收集所述多光子信号；基于收集到的所述多光子信号检测所述多光子信号强度，并判断所述多光子信号强度的变化是否在阈值范围内。4.如权利要求3所述的检测多光子成像中多光子信号强度的方法，其特征在于，所述装有待测样品的玻片上固定有橡胶环，所述重水滴在所述橡胶环的环内，防止所述重水扩散；所述橡胶环的外径为22mm，内径为15.8mm，厚度为3.1mm。5.如权利要求3所述的检测多光子成像中多光子信号强度的方法，其特征在于，所述待测样品为荧光染料，所述多光子信号为三光子荧光信号；所述带通滤光片为第一带通滤光片，用于滤除特定波长的光信号，使所述荧光染料产生的三光子荧光信号透过；所述探测器为镓砷磷探测器，用于收集所述三光子荧光信号。6.如权利要求3所述的检测多光子成像中多光子信号强度的方法，其特征在于，所述待测样品为小鼠脑部白...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱娉，王科，刘鸿吉，杜毓，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44