乳粉中大肠菌群标准样品及其制备方法技术

本发明专利技术属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种乳粉中大肠菌群标准样品及其制备方法。乳粉中大肠菌群标准样品包括目标菌群和背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌组成，所述背景菌群由马红球菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌组成。本发明专利技术均匀性、稳定性符合标准样品要求，可以最大程度保证标准样品的稳定性，即使在运输及储存中大肠埃希氏菌的含量发生变化，在统计学意义上也不会影响大肠菌群的总量；样品的制备方法，工艺简单，成功率高。

Standard sample of coliform bacteria in milk powder and preparation method thereof

The invention belongs to the field of quality control in the field of microbiological detection, in particular to a standard sample of coliform bacteria in milk powder and a preparation method thereof. Milk powder of coliform bacteria in standard samples including target bacteria and background bacteria, the target bacteria by Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, the background bacteria by Rhodococcus sp., Bacillus cereus and Staphylococcus aureus group. The invention of uniformity and stability of samples conform to the standard requirements, to the greatest extent possible to ensure the stability of the standard sample, even in the transportation and storage of the content of Escherichia coli changes, it will not affect the total coliform group with statistical significance; sample preparation method, simple process, high success rate.

【技术实现步骤摘要】
乳粉中大肠菌群标准样品及其制备方法
本专利技术属于微生物学检测方面的质量控制领域，特别涉及一种乳粉中大肠菌群标准样品及其制备方法。
技术介绍
乳粉微生物学检验领域非常特殊。目前，国内外尚未有机构制备乳粉微生物学标准样品和大规模生产的先例，仍属空白领域。目前虽有一些机构制备食品中微生物标准样品，但其均匀性和稳定性几乎不能满足要求，运输极为困难；或标准样品为仅含有目标菌的纯菌株，与实际样品差距较大，不能满足日常实验室质量控制等需要。大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化特征及血清学方面并非完全一致，其定义为：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌等。如果制备的大肠菌群样品中，目标菌群易发生变化(繁殖和死亡等)，就会导致样品的保存期短，样品的均匀性和稳定性差。因此，综合考虑细菌的生化特性，选取性质相对稳定的菌作为目标菌群对保证样品的均匀性和稳定性十分重要。大肠菌群样品制备的工艺技术要求比较高，并且样品的均匀性和稳定性与冻干的菌种、冻干的工艺条件、冻干保护剂的使用、再水化的介质等均有密切的关系。乳粉中大肠菌群指标，直接反映着乳粉的卫生质量与潜在致病风险。如果大肠菌群数超过一定限量，就加大了致病性大肠埃希氏菌的存在风险，并最终导致食源性疾病发生。因此，制备均匀性与稳定性俱佳的大肠菌群样品，可以避免大肠菌群检验的随意性和不确定性，真实地反映检测实验室的能力。这对提高实验室质量控制水平，保障乳粉安全，甚至于打破国际贸易壁垒、提高我国乳粉国际竞争力都具有特殊重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服大肠菌群测定样品中总的活的细菌数目在运输、储存和测试等过程中菌落数都可发生变化的问题，提供一种乳粉中大肠菌群标准样品，均匀性、稳定性符合能力验证要求，本专利技术的另一个目的是提供该样品的制备方法，工艺简单，成功率高。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：乳粉中大肠菌群标准样品，其特征是：包括目标菌群和背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)组成，所述背景菌群由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、马红球菌(Rhodococcusequi)组成。所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、脱脂奶粉体积分数为15％。所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103CFU/mL，背景菌群的目标浓度为103CFU/mL。一种乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：(1)菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；(2)增菌目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；(3)菌悬液配制将上一过程得到的菌液与冻干保护剂混合，按目标菌群的目标浓度102～103CFU/mL和背景菌群的目标浓度103CFU/mL配制菌悬液，分别配制4个目标菌的菌悬液和3个背景菌的菌悬液，分别按1:1体积比混合形成目标菌群悬液和背景菌群悬液，再将目标菌群悬液与背景菌群悬液按1:1体积比混合，得到混合菌悬液，置于磁力搅拌器上不断搅拌下分装到样品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要盖实；(4)冻干和包装将装有混合菌悬液的样品瓶开盖放入冻干机中，冷冻干燥40～50h，当样品冷冻干燥结束后，直接进行箱内加塞，关闭机器，样品瓶中样品为真空状态；(5)储存将样品放置在4℃条件下避光保存，从全部样品中随机挑选样品发放给参试实验室或进行均匀性和稳定性试验。所述冻干保护剂为含有海藻糖和脱脂奶粉的无菌水，其中体积分数分别为：海藻糖10％、脱脂奶粉15％。所述样品的均匀性和稳定性试验按照CNAS—GL03《标准样品均匀性和稳定性评价指南》进行。本专利技术菌种的选择采用大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌作为大肠菌群样品的目标菌群，以金黄色葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌作为背景菌群。众所周知，大肠菌群是一类在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧菌的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群中的大肠埃希氏菌比较常见，但非常容易受到环境因素(特别是温度)的影响。相比而言，以大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌作为目标菌群，可以最大程度保证测试样品的稳定性，即使在运输及储存中大肠埃希氏菌的含量发生变化，在统计学意义上也不会影响大肠菌群的总量。本专利技术的大肠菌群标准样品具有以下优势特性：活的微生物、数量不发生变化、生化特征不发生变异，从满足特殊运输的条件着手，通过特殊工艺的研究、稳定性和均匀性的研究等形成一套完善的标准样品制备技术，适合于乳粉中大肠菌群标准样品的制备。附图说明图1为本专利技术工艺流程图。具体实施方式下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步详细描述，但本专利技术并不局限于具体实施例。实施例1乳粉中大肠菌群标准样品，包括目标菌群和背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)组成，所述背景菌群由金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、马红球菌(Rhodococcusequi)组成。所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、脱脂奶粉体积分数为15％。所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103CFU/mL，背景菌群的目标浓度为103CFU/mL。实施例2如图1所示，一种实施例1中乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法，包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，具体步骤如下：1、样品添加菌株的选择按照主导菌群：大肠埃希氏菌(E.coil)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapnenmoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，背景菌群：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、马红球菌(Rhodococcusequi)选择标准菌株，所有标准菌株均购于政府指定的机构，并附有菌株证书，保证了菌株的溯源性。2、冻干保护剂的配制样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质(体积分数：海藻糖10％，脱脂奶粉15％)配制冻干保护剂。3、样品冻干(1)菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
乳粉中大肠菌群标准样品，其特征是：包括目标菌群与背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌组成，所述背景菌群由金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、马红球菌组成。

【技术特征摘要】
1.乳粉中大肠菌群标准样品，其特征是：包括目标菌群与背景菌群，所述目标菌群由大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌组成，所述背景菌群由金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、马红球菌组成。2.根据权利要求1所述的乳粉中大肠菌群标准样品，其特征是：所述样品以海藻糖、脱脂奶粉和无菌水为基质，其中海藻糖体积分数为10％、脱脂奶粉体积分数为15%。3.根据权利要求1或2所述的乳粉中大肠菌群标准样品，其特征是：所述样品中目标菌群的目标浓度为102～103CFU/mL，背景菌群的目标浓度为103CFU/mL。4.根据权利要求1所述的乳粉中大肠菌群标准样品的制备方法，其特征是：包括样品添加菌株的选择、冻干保护剂的配制、样品冻干、样品的均匀性和稳定性试验四个步骤，其中样品冻干过程为：菌株复苏传代—增菌—菌悬液配制—冻干和包装—储存，具体过程为：（1）菌株复苏传代将标准菌株接种到营养琼脂斜面培养基中，在36±1℃下使其复苏和生长，并对复苏的菌株进行鉴定；（2）增菌目标菌群培养至对数生长期末，背景菌群培养至稳定期，从斜面刮取菌落，加到10mL的冻干保护剂中制成相应单一菌种的菌液；（3）菌悬液配制将上...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢行安，吴孝槐，顾文佳，赵红阳，王秀君，王伟，孙英健，陈若晞，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11