甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp及其应用制造技术

本发明专利技术属于油菜育种技术领域。具体涉及甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp及其应用。本发明专利技术涉及的显性基因Rfp是隐性基因rfp的功能获得性变异的同源基因。本发明专利技术还公开了恢复基因Rfp的克隆、验证和应用以及在培育油菜等作物细胞质雄性不育系、保持系和恢复系的选育。本发明专利技术的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术克隆的基因也可通过转基因的技术直接用于甘蓝型油菜恢复系的培育。

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp及其应用
本专利技术属于油菜育种
具体涉及甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp及其应用。本专利技术涉及的显性基因Rfp是隐性基因rfp的功能获得性变异的同源基因。恢复基因Rfp的克隆、验证和应用可以加快油菜等作物细胞质雄性不育系、保持系和恢复系的选育，从而大大缩短育种的周期。
技术介绍
植物雄性不育是指雄配子发育异常，而雌配子发育正常，能接受外来正常花粉结实的现象(Hanson,M.R.andS.Bentolila,Interactionsofmitochondrialandnucleargenesthataffectmalegametophytedevelopment.PlantCell,2004.16:p.S154-S169)。这一现象最早由德国人科勒在1763年发现，目前已在600多种植物中有相关报道。根据遗传模式的差异，植物雄性不育主要分为核不育(Genicmalesterility,GMS)和胞质不育(cytoplasmicmalesterility,CMS)。细胞核雄性不育的遗传方式符合孟德尔遗传规律，而细胞质雄性不育则以母系遗传的形式存在(Kaul,M.L.H.,Malesterilityinhigherplants.Monographsontheoreticalandappliedgenetics；vol.10.1988,Berlin[etc.]:Springer)。而依据败育的时期和花药组织细胞学特征，细胞质雄性不育又分为绒毡层和花粉无细胞发育异常的孢子体不育(sporophyticmale-sterility)和小孢子或花粉粒发育异常的配子体不育(gametophyticmale-sterility)两种形式(Guo,J.X.andY.G.Liu,MolecularControlofMaleReproductiveDevelopmentandPollenFertilityinRice.JournalofIntegrativePlantBiology,2012.54(12):p.967-978.)。细胞质雄性不育是利用杂种优势极为有效的方式，在水稻、小麦、油菜、玉米、高粱等主要农作物的杂交育种中起了很大的作用，但是其机理仍没有被人们研究透彻(Chase,C.D.,Cytoplasmicmalesterility:awindowtotheworldofplantmitochondrial-nuclearinteractions.TrendsinGenetics,2007.23(2):p.81-90)。细胞质雄性不育现象与育性恢复是受细胞核和细胞质基因双重调控的一种母性遗传性状，是研究植物细胞质遗传和核质互作的一个极好的材料，对CMS机理的研究有助于加强对核质互作的认识(Chen,L.T.andY.G.Liu,MaleSterilityandFertilityRestorationinCrops,inAnnualReviewofPlantBiology,Vol65,S.S.Merchant,Editor.2014,AnnualReviews:PaloAlto.p.579-606)，同时对成花机制和花粉发育等植物花发育过程中的事件的研究无疑将起到推动作用。因此，研究CMS分子机理不仅具有重要的生产利用价值，还具有重要的理论意义，CMS/Rf系统也自然成为当今一个科研热点。目前，世界上可以用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统(傅廷栋,杂交油菜的育种与利用.2000:湖北科学技术出版社)。采用常规育种手段利用波里马CMS系统需要培育不育系、保持系和恢复系以实现三系配套，而在三系选育过程中伴随着大量的杂交和多代回交需要大量的人力成本和漫长的育种周期。克服这一缺陷的可行策略是克隆波里马细胞质雄性不育恢复基因，开发恢复基因的功能标记用于分子标记辅助选择，或者在此基础上直接通过基因工程技术直接创制所需的育种材料。
技术实现思路
本专利技术的目的本旨在克隆得到甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp，利用该基因恢复甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育系的育性，并在此基础上开发出功能标记，用于细胞质雄性不育系、保持系和恢复系的选育，从而加快育种进程，同时本专利技术克隆的基因也可通过转基因的技术直接用于恢复系的培育。申请人通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp，该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQIDNO：2所示。分离得到不具备恢复功能的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的隐性等位基因rfp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：3所示；该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQIDNO：4所示。可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本专利技术的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerasechainreaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本专利技术的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。本专利技术为甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育遗传改良提供了新的技术方案，其中包括作为恢复甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育不育系的育性；或作为新的不育系、保持系或者恢复系辅助选育的分子标记及其应用。在本专利技术的实施例部分，申请人阐述了显性基因Rfp和隐性基因rfp的分离、功能验证和应用过程以及这两个基因的特点。附图说明序列表SEQIDNO:1是本专利技术分离的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp的核苷酸序列，序列长度为1953bp，该基因来源于甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复系Bing409。序列表SEQIDNO:2是本专利技术分离的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp编码的蛋白质序列，编码650个氨基酸，该基因来源于甘蓝型油菜甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复系Bing409。序列表SEQIDNO:3是本专利技术分离的不具备恢复功能的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的隐性等位基因rfp的序列，序列长度为1953bp，该基因来源于甘蓝型油菜甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育不育系6330A。序列表SEQIDNO:4是本专利技术分离的不具备恢复功能的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的隐性等位基因rfp编码的蛋白质序列，编码650个氨基酸，该基因来源于甘蓝型油菜甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育不育系6330A。图1.本专利技术鉴定、分离、克隆并验证甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp和它的基因功能的流程图。图2.覆盖甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp区段的物理图谱。附图标记说明：图2中：椭圆形线表示Rfp基因精细定位的遗传图谱；分子标记下面的数字表示在近等基因系群体中检测到的Rfp点与分子标记之间发生重组交换的单株数；矩形实线表示白菜基因组测序拼接的Scaffold；线上的三角形代表相应区域白菜基因组图谱上注释的基因；连接分子标记和Scaffold的竖线表示通过序列比较分析证实了相对应的分子标记和Scaffold具有同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因Rfp，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种分离的甘蓝型油菜波里马细胞质雄性...

【专利技术属性】
技术研发人员：易斌，洪登峰，杨宗辉，刘智，傅廷栋，涂金星，杨光圣，马朝芝，沈金雄，文静，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42