一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN‑14。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术的贝莱斯芽孢杆菌SN‑14来源于贵州本土豆豉，菌株的安全性高；(2)本发明专利技术的贝莱斯芽孢杆菌SN‑14，获得的纳豆产品口感优良；(3)本发明专利技术贝莱斯芽孢杆菌SN‑14产纳豆激酶的活力较高，是研究和开发纳豆激酶产品的首要条件。因此该枯草芽孢杆菌在改善食品口感，提高发酵活性，并丰富纳豆保健品的功效上有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株及其应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种新的纳豆激酶生产菌株，还涉及一种纳豆激酶生产菌株菌株在制备纳豆中的应用，本专利技术所述的莱斯芽孢杆菌具备高产纳豆激酶的能力，可用于纳豆的生产。
技术介绍
血栓疾病重影响着人类的健康，据统计，全世界每年至少有1200万患者因血栓性疾病而死亡，中国约有260万。因此溶栓抗栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点。目前临床上常用的溶栓抗栓药物有链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)和组织型纤溶酶原激活剂(typeplasminogenactivator，t-PA)，但这些药物存在给药痛苦、副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点，相比之下，纳豆激酶(Nattokinase，NK)已被证明具有高效的溶栓作用，不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。并且纳豆激酶具有可口服、安全、廉价和纤溶性强等优势，成为近年来溶栓类产品的研究热点。纳豆食品虽具有很好的营养和保健功能，但因纳豆其特有的风味并不易被我国人民所接受，这不利于人们通过饮食去摄入纳豆激酶来降低血栓疾病发病率。由于毛霉发酵的豆豉不仅味美醇香、营养丰富，而且具有多种保健功能，是我国人民喜爱的佐餐调味佳品。目前生产中采用纯毛霉接种制曲制备的发酵豆豉因培养时间过短，产品中氨基酸态氮的含量较低，易导致货架期产品出现老化变硬，影响产品的风味。因此，纳豆食品的开发必须同时从产品感官和发酵活性上进行，才能达到最佳的效果。筛选高活性的纳豆激酶生产菌株，改善纳豆口感以及制备富含多种功能成分的纳豆食品，是今后纳豆激酶产品发展的关键。目前，已研究报道的产纳豆激酶芽孢杆菌较多，主要有枯草芽孢杆菌Bacillussubtilies、和解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens等，而芽孢杆菌Bacillusvelezensis是2005年发现的芽孢杆菌新种，随后被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体，其中文名为贝莱斯芽孢杆菌。作为一种新型细菌，有关它的研究也日益增多，但更多的是将该菌的研究重心放在了植物病害生物防治中。直到现在国内外的研究中，还均未发现将贝莱斯芽孢杆菌用于纳豆激酶的生产上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14，该菌株具备高产纳豆激酶的特点，可用于纳豆激酶保健品的生产。本专利技术还有一个目的在于提供了一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在制备纳豆中的应用，利用该菌株发酵黄豆，提高了纳豆产品中纳豆激酶的含量，并改善了纳豆的口感。本专利技术的技术方案为：一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN-14。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SN-14，保藏编号：CCTCCM2017135，保藏日期：2017年3月20日，地址：中国武汉市武汉大学。所述的贝莱斯芽孢杆菌SN-14，其细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14，其筛选过程如下：(1)利用初筛培养基分离豆豉里面的芽孢杆菌，经形态学鉴定，初步确定为芽孢杆菌。初筛培养基：3-10g/L酪素，1-5g/L葡萄糖，1-5g/L酵母膏，1-5g/LK2HPO4，0.5-2.5g/LKH2PO4，0.1-0.5g/LMgSO4，pH7.0～7.2。(2)再次利用固体发酵复筛，进行感官鉴评和测定纤溶活力，选择感官鉴评优和纤溶活力高的菌株。复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m：v＝1:3-5常温下浸泡10-12h，沥干于121℃灭菌20min。(3)最后应用纳豆激酶的PCR扩增，高效快速筛选到一株纳豆激酶生产菌株SN-14，并对该菌株进行了生理生化鉴定和16SrRNA的分子鉴定。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)SN-14，保藏编号：CCTCCM2017135。(4)一种贝莱斯芽孢杆菌菌株在制备纳豆中的应用，其应用步骤为：将筛选得到的芽孢菌菌株转接到LB斜面培养基上37℃活化18-28h，用接种环挑选2-5环的菌苔接种到液体种子培养基中，于37℃，180r/min的条件下培养16-18h处于对数生长期，然后以4％的接种量接种到灭菌的黄豆培养基上，在37℃培养36-48h，后熟24h即可。测得纳豆激酶的活力达到6583.2-8215.7IU/g(湿黄豆)。所述的液体种子培养基：10-15g/L葡糖糖，5-10g/L酵母提取物，10-15g/L牛肉膏，5-10g/LNaCl，pH7.4～7.6。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术的贝莱斯芽孢杆菌SN-14来源于贵州本土豆豉，菌株的安全性高；(2)本专利技术的贝莱斯芽孢杆菌SN-14，获得的纳豆产品口感优良；(3)本专利技术贝莱斯芽孢杆菌SN-14产纳豆激酶的活力较高，是研究和开发纳豆激酶产品的首要条件。因此该枯草芽孢杆菌在改善食品口感，提高发酵活性，并丰富纳豆保健品的功效上有很好的应用前景。附图说明图1为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在初筛培养基上的菌落形态示意图；图2为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在LB培养基上的菌落形态示意图；图3为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在琼脂糖-纤维蛋白原上的活力示意图；图4为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在固体发酵上的产物示意图；图5为一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14在油镜下观察的菌种形态图；图6为MEGA5.05用邻近法基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树；显示分离株属于Bacillusvelezensis属。Bootstrap为1000，表示经过1000次数值分析；图下标尺表示每100个碱基序列中有一个碱基替换；图7为尿激酶活力的对数值与溶解圈面积呈线性关系示意图。具体实施方式实施例1：一种贝莱斯芽孢杆菌SN-14，其筛选过程如下：(1)初筛从贵州省的遵义豆豉、贵阳豆豉、大方臭豆腐、铜仁豆豉、毕节臭豆腐、安顺豆豉和青岩豆腐等地的9种样品各取2g置于100mL的已灭菌的具塞三角瓶中，加无菌生理盐水稀释10倍，振荡30s后，于37℃，180r/min的条件下培养24h。将菌悬液置于80～85℃的水浴锅中加热10min，冷却后的菌悬液分别做梯度稀释，各取0.1mL涂布于酪蛋白平板上，37℃倒置培养24h，挑取水解圈与菌落直径比值(C/H的值)较大的菌落进行革兰氏染色及镜检，参照常见细菌系统手册中关于芽孢杆菌属的形态描述进行镜检初筛，并接种到LB平板上进行划线分离纯化，将获得的单一菌株接种到LB斜面培养上，37℃培养24h，于4℃冰箱保存备用。经初筛培养基初筛，筛选出70株疑是产纳豆激酶高活性的菌株。初筛培养基为5g/L酪素，1g/L葡萄糖，1g/L酵母膏，1g/LK2HPO4，0.5g/LKH2PO4，0.1g/LMgSO4，pH7.0～7.2。(2)复筛通过黄豆固体发酵复筛和纤溶活性的分析，筛选出15株活性较高的菌株。复筛培养基：固体培养基为黄豆洗净，与水以m：v＝1:3常温下浸泡10-12h，沥干于12本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN‑14。

【技术特征摘要】
1.一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株为贝莱斯芽孢杆菌SN-14。2.根据权利要求1所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述的贝莱斯芽孢杆菌SN-14，其细胞形态为杆状，革兰氏染色呈阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生。3.如权利要求1或2所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)利用初筛培养基分离豆豉里面的芽孢杆菌，经形态学鉴定，初步确定为芽孢杆菌；(2)再次利用固体发酵复筛，进行感官鉴评和测定纤溶活力，选择感官鉴评优和纤溶活力高的菌株；(3)最后应用纳豆激酶的PCR扩增，筛选到一株纳豆激酶生产菌株SN-14，并对该菌株进行了生理生化鉴定和16SrRNA的分子鉴定。4.根据权利要求3所述的一种产纳豆激酶贝莱斯芽孢杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：初筛培养基：3-10g/L酪素，1-5g/L葡萄糖，1-5g/L酵母膏，1-5g/LK2HPO4，0.5-2.5g/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：何腊平，高泽鑫，李翠芹，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52