尖尾芋水提物诱导单核巨噬细胞分化分泌发挥抗肿瘤功能的应用制造技术

本发明专利技术公开了尖尾芋水提物的应用，特别是尖尾芋水提物诱导抗肿瘤细胞因子的应用，该尖尾芋水提物经水煎煮后经离心分离得到。本发明专利技术通过一系列实验证明尖尾芋水提物能在体内非特异性激发和增强机体免疫功能从而控制和杀灭肿瘤细胞，也能在体外诱导THP-1细胞产生TNF-α与IL-1β等免疫相关因子。

Differentiation and secretion of monocyte macrophage induced by water extract of pointed tail taro and its application in antitumor

The invention discloses the application of the water extract of pointed tail taro, in particular to the application of the water extract of the pointed tail taro to the induction of anti-tumor cytokine, and the water extract of the pointed taro is obtained by water extraction and then separated by centrifugation. The present invention through a series of experiments show that the tip of the tail taro water extract in vivo non-specific stimulate and enhance immune function to control and kill tumor cells, but also can induce THP-1 cells generated in vitro TNF- alpha and IL-1 beta and other immune related factors.

【技术实现步骤摘要】
尖尾芋水提物诱导单核巨噬细胞分化分泌发挥抗肿瘤功能的应用
本专利技术涉及尖尾芋水提物，具体涉及尖尾芋水提物诱导单核巨噬细胞分化分泌发挥抗肿瘤功能的应用。
技术介绍
尖尾芋为天南星科植物尖尾芋(Alocasiaeucullata(Dour)Schott)的根茎，该植物广泛分布于我国广东、广西、云南、贵州、四川等省区，为《中国植物志》收录的有毒植物之一。尖尾芋中药名为卜芥，有清热解毒，消肿镇痛功效,用于治疗多种肿瘤、流感、高热不退、钩端螺旋体病、毒蛇咬伤、毒蜂螫伤、慢性支气管炎等。抗肿瘤细胞因子是由机体细胞分泌的，能通过非特异性地激发和增强机体免疫功能，使机体产生抗肿瘤免疫应答，从而控制和杀灭肿瘤细胞。目前，与肿瘤生物治疗相关的细胞因子大致可分为六类：①干扰素类：INFα、β；②白细胞介素类：IL-1～18；③集落刺激因子类：G-CSF、GM-CSF、M-CSF、TPO、EPO等；④肿瘤坏死因子类：TNFα、β；⑤转化生长因子类：TGFα、β；⑥其它：包括白血病生长抑制因子(LIF)、癌抑制素(MoncoM)等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出尖尾芋水提物的新应用，特别是尖尾芋水提物诱导抗肿瘤细胞因子的应用。进一步地，所述尖尾芋水提物按照以下方法提取而得：取天南星科植物尖尾芋的根茎，沸水提取，滤过，高速离心分离续滤液，浓缩，真空冷冻干燥得尖尾芋水提物。进一步地，所述加入蒸馏水的量为新鲜尖尾芋根茎重量的10～12倍。进一步地，所述沸水提取的次数是两次。进一步地，所述沸水提取的时间是4h。进一步地，所述高速离心分离条件为2000r/min，20min。进一步地，所述尖尾芋水提物为棕黄色粉末，有香气，易溶于水，其水溶液为淡黄色或棕黄色。进一步地，所述尖尾芋水提物中总多糖含量占66.67％，蛋白质占7.20％，其中多糖主要由D-葡萄糖和D-半乳糖组成。进一步地，所述抗肿瘤细胞因子为TNF-α与IL-1β。进一步地，所述抗肿瘤细胞因子是淋巴细胞和/或巨噬细胞分泌的。本专利技术通过实验证明尖尾芋水提物能在体内诱导荷瘤小鼠分泌免疫因子，增强小鼠免疫功能，从而抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长：尖尾芋高剂量组、阳性对照组、尖尾芋中剂量组、尖尾芋低剂量组、阴性对照组的肿瘤体积大小依次增加，组间效应差别具有统计学意义(F＝5.399，P＝0.000)，各测量时间点肿瘤体积有差异。肿瘤标本HE染色结果显示，阴性对照组瘤细胞生长致密，凋亡细胞少见。而尖尾芋高剂量组和阳性对照组肿瘤细胞较少，排列疏松，细胞轮廓不清晰。在荷瘤小鼠各组血清中，尖尾芋高剂量组与荷瘤小鼠空白对照组比较，IL-2、TNF-α、INF-γ含量均有显著性差异(p<0.01)，但TGF-β1含量差异不显著(p＝0.075)。正常小鼠各组血清中，尖尾芋组与正常小鼠空白对照组比较，IL-2、TNF-α增高，差异有显著性(p<0.05)。但是IL-10、INF-γ与TGF-β1差异不显著(p>0.05)。MTT法测尖尾芋对正常小鼠脾细胞活性，与对照组比较，尖尾芋在浓度为200mg/L的处理组差异无显著性。当浓度为500、1000mg/L的处理组与对照组比较有显著性差异，且随药物浓度增加而增加，呈浓度依赖趋势。尖尾芋对小鼠腹腔渗出细胞增殖有增强作用，与对照组比较有显著性差异。本专利技术通过实验证明尖尾芋水提物能在体外诱导THP-1细胞向巨噬细胞分化，并且产生TNF-α与IL-1β：THP-1细胞呈现单细胞悬浮状态，仅极少数细胞贴壁。在尖尾芋的培养液中诱导72h后，显示明显的免疫分化。细胞贴于玻璃瓶底部，且不能被含EDTA的胰酶消化悬浮细胞的数目与尖尾芋浓度成反比，细胞抑制率与浓度成正比。用流式细胞分析尖尾芋诱导THP-1单核细胞向巨噬细胞分化时，CD14与CD11b的表达增高。1000mg/L的尖尾芋作用细胞后，发现流式细胞直方图出现双峰，与前述细胞出现贴壁和悬浮两种形态相符，尖尾芋不能使THP-1细胞全部分化。CD14与CD11b阳性细胞比例分别为57.40％,，39.65％。与对照组比较差异具有显著性(p<0.01)，细胞荧光强度显著性增强(p<0.01)。且发现尖尾芋诱导THP-1细胞产生白介素-1β与肿瘤坏死因子-α。流式细胞仪分析细胞周期，浓度为2000，4000mg/L提取物作用THP-1细胞后，sub-G1期细胞比率分别为(22.3±4.1)％和(60.5±0.7)％，与对照组(2.1±1.0)％比较差异均有显著性(p<0.01)。趋化因子芯片实验结果发现,同空白对照比较，尖尾芋组中RANTES表达增强,并且有IL-8、MIP-la,(3、GROa的表达。细胞因子芯片实验结果,尖尾芋组中MIF表达增强,并且有MIP-louMIP-ip、IL-8,GROa、IL-lm、RANTES、TNF-a的表达。本专利技术的有益效果是：1.本专利技术从尖尾芋中提取出水煎煮部分。2.本专利技术提取制备尖尾芋水提取的方法快速有效，安全可靠，且原料来源广泛，适合大规模生产。3.本专利技术通过实验证实尖尾芋水提物能在体内非特异性激发和增强机体免疫功能从而控制和杀灭肿瘤细胞，也能在体外诱导THP-1细胞产生TNF-α与IL-1β等免疫相关因子，可以开发成预防与治疗恶性肿瘤的药物制剂。附图说明图1.各组小鼠血清中细胞因子的含量。**p<0.01与荷瘤小鼠阴性对照组比较。#p<0.05，与未接种肿瘤小鼠阴性对照比较。图2.尖尾芋对正常小鼠脾细胞的生长活性影响。图3.尖尾芋对THP-1细胞形态的影响(200倍)。图4流式细胞仪检测THP-1细胞表面标记分子CD14与CD11b的表达。图5尖尾芋诱导THP-1细胞产生IL-1β。图6尖尾芋诱导THP-1细胞产生TNF-α。具体实施方式实施例11.尖尾芋水提物的提取取新鲜尖尾芋根茎，洗净切碎，置于60℃烘箱烤干。粉碎，过筛。称取1000g尖尾芋粉末，沸水提取两次，加水量分别为12mL·g-1，10mL·g-1生药，每次4h，滤过，合并滤液，浓缩至约1000mL，放冷，在2000r/min下高速离心20min，收集滤液。真空冷冻干燥机干燥，得尖尾芋水提物，备用。所得尖尾芋水提物为棕黄色粉末，有香气，易溶于水，其水溶液为淡黄色或棕黄色。2.糖含量测定精密量取0.1mg/mL葡萄糖标准溶液0、1、2、3、4、5、6、7mL于10mL容量瓶中定容，再分别从各管中取葡萄糖溶液2mL，各管加入5％苯酚试剂1mL，混匀，加入浓硫酸5mL，静置5min，充分振摇，室温冷却30min，在487nm波长处检测，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。中性糖含量测定采用苯酚硫酸法，以葡萄糖为对照品。精密称取葡萄糖对照品适量，加水溶解，制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照溶液。精密吸取供试品溶液2mL于10mL具塞试管中，分别加入5％苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，混匀，放置20min，测定吸收度，根据回归方程计算供试品溶液中相当于葡萄糖的量。尖尾芋水提物中总多糖含量占66.67％。3.蛋白质含量测定精密量取10μg/mL的BSA标准溶液0、20、40、60、80、100μL置于试管中，各管分别加蒸馏水至100μL，加入5mL考本文档来自技高网...

【技术保护点】
尖尾芋水提物在制备诱导单核巨噬细胞分化分泌抗肿瘤细胞因子的药物的应用，其中所述尖尾芋水提物按照以下方法提取而得：取天南星科植物尖尾芋的根茎，沸水提取，滤过，高速离心分离续滤液，浓缩，真空冷冻干燥得尖尾芋水提物。

【技术特征摘要】
1.尖尾芋水提物在制备诱导单核巨噬细胞分化分泌抗肿瘤细胞因子的药物的应用，其中所述尖尾芋水提物按照以下方法提取而得：取天南星科植物尖尾芋的根茎，沸水提取，滤过，高速离心分离续滤液，浓缩，真空冷冻干燥得尖尾芋水提物。2.尖尾芋水提物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述尖尾芋水提物按照以下方法提取而得：取天南星科植物尖尾芋的根茎，沸水提取，滤过，高速离心分离续滤液，浓缩，真空冷冻干燥得尖尾芋水提物。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述加入蒸馏水的量为尖尾芋根茎重量的5-20倍,优选为10～12倍。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡红兵，黄嘉维，李欣，郝亚娟，邵萌，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44