本发明专利技术公开了一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法及降低红火蚁抗药性的应用，本发明专利技术通过dsCYP6A1‑like和dsCYP4C1‑like的CDs区域来设计合成dsRNA，通过饲喂方法测定靶标基因和其它同源P450基因沉默效果，和对外源化合物的敏感度测定，明确红火蚁P450对外源化合物的解毒代谢作用。本发明专利技术通过qRT‑PCR技术检测沉默效果，结果表明，饲喂dsRNA24h后，RNAi介导的dsCYP6A1‑like和dsCYP4C1‑like分别对CYP6A1‑like和CYP4C1‑like mRNA的沉默效果显著，与对照组相比，达到沉默效率分别达到64.6和77.1％。
Method for preventing red fire ant by using RNA interference and application of reducing resistance of red imported fire ant
The invention discloses a method for using RNA to combat fire ants and reduce the application of S.invicta resistance, the invention by dsCYP6A1 CDs and dsCYP4C1 like regional like to design and synthesis of dsRNA, by feeding method for determination of target genes and other homologous P450 gene silencing effect and sensitivity determination of exogenous compounds clearly, the detoxification of xenobiotics P450 ants. The present invention by detecting the silencing effect of PCR technology, qRT results showed that after feeding dsRNA24h mediated by RNAi dsCYP6A1 like and dsCYP4C1 like respectively on CYP6A1 like and CYP4C1 like mRNA silencing effect significantly, compared with the control group, to reach 64.6 and 77.1% respectively. The silence efficiency.
【技术实现步骤摘要】
一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法及降低红火蚁抗药性的应用
本专利技术涉及红火蚁的防治技术，具体涉及一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法及降低红火蚁抗药性的应用。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是近年来发现的一种新的基因调控方法(Matzke,2001)。即利用外源或内源的双链RNA(dsRNA)特异性地引起基因表达沉默的现象。它利用RNA序列匹配，专一地识别靶基因，在转录水平、转录后水平或翻译水平抑制靶基因表达，已被广泛用于基因功能研究、疾病治疗和农业应(Waterhouse,2003；Matthew,2004)，目前，RNAi技术已被应用于鳞翅目、直翅目、膜翅目(意大利蜜蜂)、同翅目、双翅目瞪昆虫。昆虫RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、转基因和病毒介导等方法。比较常用的是注射和饲喂两种方法。注射dsRNA到昆虫中以抑制基因表达，这种方法的主要优点是效率高，但也有一些缺点。通过喂食dsRNA操作简单方便，容易实现。通过饲喂dsRNA已在半翅目、鞘翅目和鳞翅目昆虫取得成功(Baumetal.,2007；Maoetal.,2007)。红火蚁(S.invicta)是最具有入侵性的社会性昆虫，已经被国际上列为最具入侵性和破坏性的百种外来有害生物之一。红火蚁食性复杂、习性凶猛、繁殖迅速、竞争力强，能造成重大经济损失、社会危害和环境影响，红火蚁的杂食性和攻击性使其不仅是一种经济害虫，还威胁到公众健康。化学防治措施仍然是防治红火蚁有效措施，但仍然不能根除红火蚁。而且长期用化学药剂对红火蚁进行控制，会导致意想不到的反弹。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术利用饲喂dsRNA方法分别干扰红火蚁工蚁CYP6A1-like和CYP4C1-like两个P450基因，并检测红火蚁工蚁对外源化合物的的敏感度和酶活性的变化，进一步明确CYP6A1和CYP4C1的解毒代谢功能。本专利技术的技术方案是：一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法，向红火蚁饲喂制得的dsRNA。本专利技术的进一步改进包括：向饲喂过dsRNA的红火蚁施用氟虫腈和/或毒死蜱。所述的dsRNA是dsCYP6A1-like和/或dsCYP4C1-like。本专利技术的另一目的在于提供一种制备上述dsRNA的方法，通过dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like的CDs区域来设计合成dsRNA。本专利技术还提供了dsCYP6A1-like在降低红火蚁对氟虫腈抗药性中的应用。附图说明图1是以dsGFP(288bp)，dsCYP6A1-like(376bp)和dsCYP4C1-like(419bp)为靶基因的dsRNA合图。图2a是RNAi介导的dsCYP6A1-like对CYP6A1-like和CYP4C1-likemRNA的沉默效果检测。图2b是RNAi介导的dsCYP4C1-like对CYP6A1-like和CYP4C1-likemRNA的沉默效果检测。图3a是RNAi介导的dsCYP6A1-like对其它P450mRNA的影响检测。图3b是RNAi介导的dsCYP4C1-like对其它P450mRNA的影响检测。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做详细说明。1材料与方法1.1供试虫源和饲养供试红火蚁采自广东广州五山。参照Kuriachan等方法，用大塑料桶从田间采回红火蚁蚁群，放置1-2d，待蚁群在桶内建立了新的群落后，将自来水缓慢滴入桶内，令红火蚁从群落中自动上移、浮出。用40目的捞网将蚁群转入盆口涂以爽身粉的塑料盆(7.0L)中，在室内(室温25℃,RH65％-80％)用人工饲料饲养一周后供试验用。工蚁、兵蚁、有翅雄蚁、有翅雌蚁和蚁后和幼蚁的判断标准参考曾玲等(2005)方法。1.2主要试剂TRIzolReagent，PlatinumSYBRGreenqPCRSuperMix-UDGKit。LaTaq聚合酶，PrimeScript1ststrandcDNAsynthesizekit，DNaseI(Takara)。QIAquickPCR产物回收试剂盒。RNAi试剂盒。1.3主要仪器5417R冷冻离心机，Nanodrop2000微量紫外分光光度计，MastercyclerPersonalPCR仪，mini-subcellGT型电泳槽，power/PAC3000型电泳仪，Kodak电泳凝胶成像仪，荧光定量PCR仪ABI7500System，微量操作系统Nanoliter2000/B203XVB。1.4含T7启动子的模板DNA制备1.4.1T7启动子引物设计根据NCBI报道EST设计特异性引物(Table4-1)，采用5’-RACE和3’-RACE技术，克隆获得4条红火蚁P450全长cDNA序列，克隆的红火蚁核苷酸序列和推导的氨基酸序列已经提交GenBank分别命名为CYP6A1(AccessionNo:KF547037)，CYP6A14(AccessionNo:KF547038)，CYP4C1(AccessionNo:KM006494)(附表1-1)，和CYP4G15(AccessionNo:KM006495)(附表1-2)。CYP6A1的全长cDNA序列2064bp，包含一个1497bp的开放阅读框(ORF)，一个238bp的5’非编码区(5’UTR)和一个293bp的带有加尾信号的3’非编码区(3’UTR)。开放阅读框从239个核苷酸开始，终止于第1771个核苷酸，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为499个氨基酸。该基因的氨基酸残基中均含有昆虫P450蛋白的5个保守结构域(Feyereisen,2005)，wxxxR(螺旋C,127-131)，AGxE/DT(螺旋I,302-307)，ExxR(螺旋K,360-383)，PxxFxPxRF(PERF,411-419)，PFxxGxRxCxG(血红素结合区,434-445)，而且这些保守结构域，特别是与分子氧结合的功能活性位点螺旋I和P450蛋白特有的血红素结合区。CYP6A14的全长cDNA序列有1950bp，包含一个1500bp的开放阅读框(ORF)，一个211bp的5’非编码区(5’UTR)和一个176bp的带有加尾信号的3’非编码区(3’UTR)。开放阅读框从212个核苷酸开始，终止于第1774个核苷酸，由其推导的氨基酸序列以甲硫氨酸为起始氨基酸，长为500个氨基酸。该基因的氨基酸残基中均含有昆虫P450蛋白的5个保守结构域(Feyereisen,2005)，wxxxR(螺旋C,128-132)，AGxE/DT(螺旋I,303-308)，ExxR(螺旋K,361-384)，PxxFxPxRF(PERF,412-420)，PFxxGxRxCxG(血红素结合区,435-446)，而且这些保守结构域，特别是与分子氧结合的功能活性位点螺旋I和P450蛋白特有的血红素结合区。该基因还在N端具有由脯氨酸，甘氨酸富集而成的高度疏水性质保守结构域(P/I)PGPx(P/G)xP，而这是微粒体P450基因的代表性特征(Bassetteta1.,1997)，预测认为CYP6A1和CYP6A14是一类稳定蛋白家族一员，这些为CYP6A1和CYP6A14蛋白的表达和纯化和植物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法，其特征在于，向红火蚁饲喂制得的dsRNA。
【技术特征摘要】
1.一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法，其特征在于，向红火蚁饲喂制得的dsRNA。2.根据权利要求1所述的一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法，其特征在于，向饲喂过dsRNA的红火蚁施用氟虫腈和/或毒死蜱。3.根据权利要求1所述的一种利用RNA干扰防治红火蚁的方法，其特征在于，所述的d...
【专利技术属性】
技术研发人员：张百重，谢兰芬，李广领，王建华，孔凡彬，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41
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