基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种基于δ‑戊内酯的聚合物，其结构由红外、核磁和凝胶渗透色谱表征。本发明专利技术还公开了基于δ‑戊内酯的聚合物的制备方法及应用，通过Click反应，开环聚合反应制备，反应简单方便、产率高。本发明专利技术的基于δ‑戊内酯的聚合物在一定条件下可降解，与核酸作用形成易于细胞摄取的纳米颗粒；绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)表达实验证明了这类聚合物可以作为可降解的非病毒基因载体，且具有较高的转染效率；聚合物和转基因载体的制备方法简单、成熟、易于掌控。

Delta valerolactone polymer and its preparation method and application based on

The invention provides a delta valerolactone polymer based on its structure by IR, NMR and GPC. The invention also discloses a based on Delta valerolactone polymer preparation method and application of the Click reaction, ring opening polymerization, preparation, reaction is simple and convenient, high yield. The invention of the delta valerolactone based polymers under certain conditions can be degraded, the formation of nano particles tend to cellular uptake with nucleic acid; green fluorescent protein (GFP) and luciferase (Luciferase) expression experiments prove that this kind of polymer can be used as non viral gene vectors can be degraded, and has high transfection efficiency; preparation method of polymer and transgenic vectors is simple, mature, easy to control.

【技术实现步骤摘要】
基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用
本专利技术属于基因载体
，具体涉及一种可作为非病毒基因载体的基于δ-戊内酯的聚合物及其制备方法与应用。
技术介绍
基因治疗是将外源正常基因导入病体细胞以替换或修补缺陷的基因，从而达到治疗相应疾病的目的。在细胞膜上有很多带有负电荷的糖蛋白和糖脂化合物，核酸的骨架结构中的磷酸基团也带有负电荷，并且核酸本身具有较大的体积，因此裸露的核酸难以被细胞吞噬。为了解决裸露核酸难以被细胞摄取的难题，科研工作者们发展了基因载体。基因载体可以有效的将细胞外的核酸带入细胞内，并可以一定程度上保护核酸在细胞核不被核酸酶水解。另外，基因载体在运输核酸进入细胞后，也可以将核酸释放，而被释放的核酸又可以进入细胞核进行相应的蛋白表达，最终达到基因治疗的目的。基因载体一般可分为两类，一类是病毒型载体，一类是非病毒载体。通常，病毒型载体的转染效率很高，并且可进行迅速表达，因而病毒型载体在临床试验中被广泛使用。但是，病毒型载体也有其固有的缺陷，如：潜在的免疫原性和致瘤性；携带的核酸尺寸有限(通常为2-3kb)；制备和存储困难复杂等。而非病毒型载体不仅仅可以完全避免上述缺陷，且其本身还有很多其他优点，如结构可调、可大规模生产和具有靶标性。这些特性更利于非病毒载体在基因治疗中的应用。但是非病毒基因载体也有一些问题需要解决，就是转染效率相对病毒基因载体低、毒性相对较大。因此，发展高效低毒的非病毒基因载体是非常重要的。目前，非病毒类载体有很多种，包括阳离子化合物，阳离子脂质体，阳离子聚合物，功能纳米粒子，无机配合物以及量子点等。在阳离子聚合物中，聚酯类由于其酯键可水解，容易被降解，所以应用到临床的可能性更大。所以，基于聚酯的非病毒基因载体的设计与合成对可降解的非病毒基因载体具有重要意义。
技术实现思路
作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本专利技术的专利技术人已经发现，α,β-不饱和δ-戊内酯上连接不同的侧链，按照不同比例开环聚合得到不同聚合物，它们可以有效凝聚DNA，并与DNA形成纳米颗粒通过内吞作用进入细胞中，利于跨膜，采用该聚合物形成的基因载体具有较高的转染效率，具有较低的细胞毒性。基于这种发现，完成了本专利技术。本专利技术的一个目的是解决至少上述问题或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种制备基于δ-戊内酯的聚合物的方法，在α,β-不饱和δ-戊内酯的基础上，连接不同的侧链，按照不同比例开环聚合得到不同聚合物，制备方法简单方便，产率高；制得的聚合物可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，利于细胞摄取。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种基于δ-戊内酯的聚合物，所述基于δ-戊内酯的聚合物具有下面显示的[化学式1]中的结构：[化学式1]其中，R2是选自含硫的直链烷基中的任意一种，n大于或等于1，m大或等于0。优选的是，其中，R2是选自含有硫的C4、C8、C12和C16直链烷基中的一种。优选的是，其中，R2为和中的一种。优选的是，其中，所述聚合物为嵌段共聚物，无规共聚物和均聚物中的一种。本专利技术的目的还可以进一步由基于δ-戊内酯的聚合物的制备方法来实现，所述方法包括以下步骤：步骤一、通过click反应制备下面显示的[化学式2]与[化学式3]的单体化合物；步骤二、[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物进行开环聚合反应制备[化学式1]所示的基于δ-戊内酯的聚合物；其中，[化学式2][化学式3]其中，a为2，6，10或14。优选的是，其中，所述步骤一中，具体包括以下步骤：S1.按比例称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入溶剂，在氩气氛围下反应，反应后减压浓缩干，减压蒸馏，得到化合物[化学式2]单体化合物；S2.按比例分别称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇，催化剂，加入溶剂溶解，在氩气氛围下反应8-10h，反应结束后，减压浓缩，硅胶柱层析分离得到[化学式3]单体化合物。优选的是，其中，所述步骤二中，基于δ-戊内酯的聚合物为嵌段聚合物，无规共聚物或均聚物，其中，嵌段聚合物的合成步骤具体为：称取[化学式2]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，当转化率为80％以上时，再按比例加入[化学式3]单体化合物，形成嵌段聚合物，其中，[化学式2]单体化合物、[化学式3]单体化合物、引发剂的摩尔比为20:20-30:1；无规共聚物的合成步骤具体为：分别称取[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成无规共聚物，其中，[化学式2]单体化合物、[化学式3]单体化合物、引发剂的摩尔比为10:10:1；均聚物的合成步骤具体为：称取[化学式2]单体化合物，加入引发剂和催化剂，在手套箱内进行开环聚合反应，形成均聚物，其中，[化学式2]单体化合物与引发剂的摩尔比为40:1。优选的是，其中，所述S2步骤中，环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇的摩尔比为1:1，催化剂为三丁基膦，溶剂为二氯甲烷。优选的是，其中，引发剂为卞醇，催化剂为1,5,7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯。本专利技术的目的还可以进一步由基于δ-戊内酯的聚合物在非病毒基因载体中的应用来实现。本专利技术至少包括以下有益效果：1、提供不同的基于δ-戊内酯的聚合物，可以有效凝聚DNA，并利用静电作用与DNA形成合适大小的纳米颗粒通过内吞作用进入细胞中；2、以基于δ-戊内酯的聚合物作为基因载体细胞毒性较低，表现出很好的转染效果，有些甚至超过商品化的PEI25k，这为聚酯类作为基因载体的进一步研究做了很好的铺垫；3、基于δ-戊内酯的聚合物的制备方法简单、成熟、易于掌控；4、基于δ-戊内酯的聚合物与细胞具有好的相容性，具有作为基因治疗中非病毒载体的潜力；5、基于δ-戊内酯的聚合物能全部包裹DNA，可作为DNA跨膜、转运的良好载体；6、基于δ-戊内酯的聚合物与DNA凝聚后的粒径，与DNA形成100-250nm大小的颗粒，这对成功穿入细胞膜实现基因转染具有重要的意义；7、基于δ-戊内酯的聚合物在一定条件下可以降解，这为可降解的聚合物作为非病毒基因载体的研究提供了一个平台。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图2为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物的动态光散射粒径图；图3为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物的扫描电子显微镜图；图4为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物在A549、Hek293T、HeLa与HepG2细胞中细胞毒性图；图5为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物的细胞摄取图；图6为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；图7为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物与质粒DNA的复合物在A549、Hek293T、HeLa与HepG2细胞中的荧光素酶报告基因转染实验图；图8为本专利技术的基于δ-戊内酯的聚合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于δ‑戊内酯的聚合物，其特征在于，所述基于δ‑戊内酯的聚合物具有下面显示的[化学式1]中的结构：[化学式1]

【技术特征摘要】
1.一种基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，所述基于δ-戊内酯的聚合物具有下面显示的[化学式1]中的结构：[化学式1]其中，R2是选自含硫的直链烷基中的任意一种，n大于或等于1，m大或等于0。2.如权利要求1所述基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，R2是选自含有硫的C4、C8、C12和C16直链烷基中的一种。3.如权利要求2所述基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，R2为中的一种。4.如权利要求1所述基于δ-戊内酯的聚合物，其特征在于，所述聚合物为嵌段共聚物，无规共聚物和均聚物中的一种。5.一种制备如权利要求1～4任意一项所述基于δ-戊内酯的聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、通过click反应制备下面显示的[化学式2]与[化学式3]的单体化合物；步骤二、[化学式2]单体化合物与[化学式3]单体化合物进行开环聚合反应制备[化学式1]所示的基于δ-戊内酯的聚合物；其中，[化学式2][化学式3]其中，a为2，6，10或14。6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤一中，具体包括以下步骤：S1.按比例称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇，加入溶剂，在氩气氛围下反应，反应后减压浓缩干，减压蒸馏，得到化合物[化学式2]单体化合物；S2.按比例分别称取环外的α,β-不饱和δ-戊内酯和正丁基硫醇、正辛基硫醇、正十二烷基硫醇或正十六烷基硫醇，催化剂，加入溶剂溶解，在氩气氛围下反应8-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢忠林，宋玲，丁爱祥，何兰，龚兵，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：北京,11