影响烟草色素含量的NtFERL基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一个影响烟草色素含量的

【技术实现步骤摘要】
影响烟草色素含量的NtFERL基因及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一个影响烟草色素含量的NtFERL基因及其应用的专利申请。
技术介绍
烟草是双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(Nicotiana)有60多个种，其中2个栽培种中的普通烟草(又称红花烟草，Nicotianatabacum)占据主要面积，黄花烟草(Nicotianarustica)的面积很小。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是栽培最广的普通烟草。我国烤烟种植面积和总产量均居世界第一位。作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。为使在未来的国内外市场竞争中立于不败之地，满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须提高烟叶品质和安全性。植物色素是烟草中一类重要的化合物，主要包括叶绿素和类胡罗卜素类物质。叶绿素在烟草成熟和烟叶调制过程中会大量降解消失，其主要降解方式有两种：一种方式是叶绿素由噗啉环降解产生吡咯类化合物，从而增加烟叶陈化香；另一种方式是叶绿素水解产生的植醇可进一步降解成新植二烯，并再降解成植物呋喃，转化成烟叶的清甜成分。一般而言，叶绿素充分降解后对烟质有利，但如果不能降解完全，在干烟叶中，叶绿素就会变成一种不利的化学成分，进而使烟叶带有明显青杂气。如果叶绿素在调制处理过程中没有充分降解就把烟叶烤干，就会烤出不同程度的“青黄烟”。“青黄烟”不仅外观品质不良，而且对于烟叶质量影响十分明显；因而叶绿素是否降解充分是烟叶分级中被严格控制的指标之一。烟叶中的黄色素主要是类胡萝卜素，烟叶中的类胡萝卜素含量与烟叶品质存在正相关关系，一方面是烟叶外观品质与该类成分含量直接相关；另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质，对烟草的香气量和香气品质呈正相关关系。烟叶中的香味成分很大一部分是类胡萝卜素的降解产物，其中不少化合物是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮和异佛尔酮等。由于烟叶中色素类物质与烟叶品质、烟叶质量关系十分紧密，因而对烟叶色素有关基因的充分和深入研究，从而对色素类物质进行有针对性调控，对于烟叶品质改善和烟叶品种改良具有十分重要的理论和应用意义。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一个影响烟草色素含量的NtFERL基因，从而能够对烟草中色素类物质含量有所调控，进而为烟草质量改善奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一个影响烟草色素含量的NtFERL基因，包括2667bp碱基，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；其中第2017-2405位核苷酸是其特异性核心片段。所述影响烟草色素含量的NtFERL基因所编码蛋白，包括888个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述影响烟草色素含量的NtFERL基因在烟草中的应用，该基因与烟草色素含量高度相关，将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量明显降低。用于沉默影响烟草色素含量NtFERL基因的RNAi载体TRV2-NtFERL，构建方法为：以NtFERL基因中第2017-2405位核苷酸作为VIGS的引导序列，将此核酸片段插入TRV2-LIC载体中，构建获得TRV2-NtFERL载体。所述用于沉默影响烟草色素含量NtFERL基因的RNAi载体TRV2-NtFERL在植物中的应用，用于沉默NtFERL基因，进而下调植物中色素类物质表达量。利用所述用于沉默影响烟草色素含量NtFERL基因的RNAi载体TRV2-NtFERL所构建的NtFERL基因沉默植物新品种的培育方法，具体方法为：通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术等干扰、沉默、敲除NtFERL基因，可获得色素含量变化的烟草转化植株新品种（也可采用其他载体以对NtFERL基因进行超量表达，构建NtFERL基因超表达转基因植物新品种）；具体而言：利用农杆菌介导的转化方法，将RNAi载体TRV2-NtFERL转化植株，通过筛选、鉴定获得NtFERL基因沉默植株，所述NtFERL基因沉默植株其表型为，基因沉默的转基因植株中色素类物质含量比正常植株明显下降。本申请中，通过对烟草NtFERL基因的克隆、对应蛋白的分析，专利技术人发现该基因在烟草色素合成途径调控上具有重要的用途，与植物叶片中色素类物质含量高度相关。进一步通过病毒介导的基因沉默技术，专利技术人发现在将NtFERL基因沉默后，新的转基因植株中的色素类物质含量明显降低。利用这一特性，可为烟草的基因工程育种或其他植物新品种培育提供新的策略和路径。附图说明图1与对照植株相比NtFERL基因沉默植株中该基因的相对表达量；图2病毒诱导沉默NtFERL基因后的表型分析；图3病毒诱导NtFERL基因沉默的烟叶及对照烟叶中的主要色素含量比较。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。生物材料：烟草材料，栽培烟草（Nicotianatabacum）K326品种，购买于玉溪中烟种子有限责任公司；本氏烟（Nicotianabenthamiana），种子由中国农业科学院烟草研究所馈赠；沉默烟草基因所用到的载体质粒TRV2-LIC、TRV1、TRV2、TRV2-PDS载体等，购买于中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心；基因测序及引物合成由上海生工生物工程有限公司提供完成；实验试剂：限制性内切酶、dATP、dTTP、PrimerSTARGXLDNApolymerase、DNA凝胶回收试剂盒MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit、质粒DNA小量纯化试剂盒MiniBESTPlasmidpurificationKit、乙酰丁香酮等，均为TAKARA生物技术有限公司产品；T4DNApolymerase、RNA提取TRIZOL试剂等，为Invitrogen公司产品；反转录试剂盒，Roche公司产品；DNAase酶，Fermentas公司产品；MES，Sigma公司产品；卡那霉素、利福平等抗生素购于上海生工生物工程有限公司；部分试剂配方及配制方法简要说明如下：（1）LB液体培养基（1L）：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化钠（NaCl），5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；（2）1M2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解MES，过滤灭菌，-20℃储存备用；（3）200mM乙酰丁香酮（Acetosyringone）储备液：无水乙醇溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；实验仪器：梯度PCR仪Mastercyclerepgradient（用于克隆目的基因片段），德国eppendorf公司产品。实施例1本实施例主要就影响烟草色素含量的NtFERL基因的获得过程，简要介绍如下：（1）烟草RNA提取及cDNA合成RNA提取，具体可参考如下步骤：以生长4周大小的栽培烟草K326幼嫩叶片为样品，经液氮充分研磨成粉状后，取约100mg粉末状材料置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个影响烟草色素含量的

【技术特征摘要】
1.一个影响烟草色素含量的NtFERL基因，其特征在于，包括2667bp碱基，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；其中第2017-2405位核苷酸是其特异性核心片段。2.权利要求1所述影响烟草色素含量的NtFERL基因所编码蛋白，其特征在于，包括888个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述影响烟草色素含量的NtFERL基因在烟草中的应用，其特征在于，该基因与烟草色素含量高度相关，将该基因沉默后，烟草中色素类物质含量明显降低。4.用于沉默权利要求1所述影响烟草色素含量NtFERL基因的RNAi载体TRV2-NtFERL，其特征在于，构建方法为：以NtFERL基因中第2017-2405位核苷酸作为VIGS的引导...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐国云，周会娜，申晓晔，张慧，郑庆霞，金立锋，刘萍萍，陈霞，翟妞，陈千思，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南,41