一种利用miR‑143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用miR‑143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法，通过在肌萎缩部位注射microRNA‑143(miR‑143)抑制剂，从而延缓失神经肌肉萎缩过程。首先通过对小鼠进行坐骨神经切断术，构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型，通过实时定量PCR检测miR‑143的表达量，比较腓肠肌肌肉湿重和肌纤维直径，然后在肌萎缩部位注射miR‑143抑制剂，显著降低了小鼠腓肠肌中miR‑143的表达量，注射了10nmol miR‑143抑制剂的小鼠失神经腓肠肌组织肌纤维的直径明显高于对照组，本发明专利技术建立了一种通过注射miR‑143抑制剂降低小鼠腓肠肌中miR‑143的表达量，从而延缓小鼠失神经腓肠肌肌肉萎缩过程的方法。

A method of using miR 143 inhibitors were delayed after denervation muscle atrophy

The invention relates to a method for using miR 143 inhibitors were delayed after denervation muscle atrophy, muscle atrophy by injection of microRNA 143 parts (miR 143) inhibitors, thus delaying denervated muscle atrophy process. Firstly mice sciatic nerve transection, construction of gastrocnemius muscle denervation atrophy model, through the expression detection of miR real-time PCR 143, compared to the gastrocnemius muscle wet weight and muscle fiber diameter, and muscle atrophy were injected miR 143 inhibitor, significantly reduce the expression of miR 143 mice in gastrocnemius muscle injected with 10nmol miR 143 inhibitor in mice denervated gastrocnemius muscle fiber diameter was significantly higher than the control group, the invention establishes a lower expression of miR 143 mice in gastrocnemius muscle by injection of miR 143 inhibitors, thus delaying nerve gastrocnemius muscle atrophy process method of mice lost.

【技术实现步骤摘要】
一种利用miR-143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法
本专利技术属于生物
的细胞及组织工程技术，具体涉及一种利用miR-143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法。
技术介绍
骨骼肌是周围神经系统的靶器官，周围神经具有支配肌肉运动收缩的功能，肌肉的生长、发育及正常的功能维持都有依赖于运动神经的支配和调节。周围神经系统受到损伤后，因为神经元不再通过轴浆运输营养给相应骨骼肌纤维，从而使骨骼肌失去神经的支配作用，失去运动收缩功能，逐渐发生萎缩。失神经肌肉萎缩是一个复杂的过程，神经受到损伤后会有多种蛋白和基因的表达发生改变。周围神经损伤后，骨骼肌会出现肌肉质量下降、肌纤维直径减小等变化，发生萎缩，进而丧失运动能力。骨骼肌失神经性萎缩是因为肌肉失神经支配后，神经元无法为骨骼肌提供营养因子，导致骨骼肌废用、萎缩，因此骨骼肌失神经性萎缩也称为失营养性萎缩或废用性萎缩，只有使神经重新获得再支配能力，才能有效防止肌肉萎缩。神经的再生速度缓慢，而骨骼肌再生依赖于支配它的运动神经纤维的存在，所以失神经肌肉的再生比较困难，因此，如何延缓和防止失神经后肌肉萎缩，并尽量保持肌肉正常功能成为目前肌肉功能和损伤修复研究的难题。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为22nt、可以抑制mRNA翻译的非编码小分子RNA，具有重要的生物学功能。其作为一类重要的基因表达调控因子，在细胞分裂、增殖、分化和死亡过程中起着重要的调控作用。miRNA在肌肉的发生、发育和损伤修复中都发挥着重要的作用。有研究发现，抑制miR-351的表达可以促进成肌前体细胞的凋亡，抑制增殖，过表达miR-351可以促进肌前体细胞进入分化状态，抑制凋亡，这说明miR-351对肌细胞的增殖与分化发挥着重要作用。有研究显示，骨骼肌特异性miRNA(miR-1、miR-133、miR-206等)与失神经后骨骼肌萎缩的调控密切相关，大鼠失神经后，随着时间的延长，miR-1和miR-133的表达先下降，之后逐渐升高。也有研究表明，在注射细胞毒素造成的肌肉损伤模型中，注射miR-675-3p和miR-675-5p可促进肌损伤的修复。miRNA在神经损伤修复过程中起着重要作用，有报道称，切断鼠脊神经后，miR-21表达水平升高，而miR-21可促进轴突的生长，表明某些miRNA可能对神经损伤具有修复作用。此外，miRNAs可通过对靶基因的调控作用参与到特定的信号通路中，促进受损神经的修复与再生，研究表明miR-206可通过对FGFBP1(FGFbindingprotein1)蛋白表达的调控作用，影响神经肌肉接头的神经再支配。由此可见，miRNAs在成肌分化和神经形成过程中发挥着重要的调控作用。而失神经肌肉萎缩的修复与再生机制与神经形成和肌细胞的自我更新有着密切的联系，建立延缓小鼠失神经支配肌肉萎缩过程的方法就成了本领域技术人员亟待解决的课题。目前已有采用调控miRNA表达来治疗肌损伤的研究报道，但数量不多，针对的miRNA种类和具体的损伤类型也各不相同，通过检索，我们检索到授权公告号为：101448942B，名称为：调节肌细胞增殖和分化的MICRORNA的相关专利技术专利，该专利根据细胞增殖分化的相关研究结果提出了在体内调控miRNA表达水平来治疗肌损伤的方法，在实施方案中该专利将miR-133和miR-1或者它们的抑制剂的组合给予肌损伤部位以改善肌损伤的康复，该专利虽然在靶向miRNA的选择上提到了miR-143，但并未对miR-143的使用方法和效果进行验证，另外，该专利针对的肌损伤类型为机械性肌损伤及肌组织退行性疾病(肌营养不良或神经元病变等)，并未对失神经肌肉萎缩的案例进行分析。本专利技术专利前期研究中，我们发现miR-143对骨骼肌卫星细胞的体外增殖分化过程具有调控作用(前述专利并没有miR-143对骨骼肌卫星细胞具有调控作用的研究基础)，miR-143在体内对肌损伤修复是否具有一定的调节作用还不清楚。
技术实现思路
鉴于目前miR-143在体内对肌损伤修复是否具有一定的调节作用，且作用是否具有良好的效果还不清楚，本专利技术构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型，通过在肌萎缩部位注射microRNA-143(miR-143)抑制剂，从而延缓失神经肌肉萎缩过程。本专利技术的目的在于提供一种通过抑制miR-143表达来延缓小鼠失神经支配肌肉萎缩过程的方法，借助此方法可以为失神经肌肉损伤修复中miRNAs的利用提供一定的借鉴，并为失神经肌萎缩机制及其临床诊治的深入研究提供新的思路和参考。本专利技术的技术方案如下：一种利用miR-143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法，方法步骤包括：在小鼠切除坐骨神经后的后肢腓肠肌内注射混有10nmolmiR-143抑制剂的100μlOpti-MEM培养基，注射在小鼠失神经术后分多次进行。而且，所述miR-143抑制剂在术后分多次进行注射的具体方法是：术后分三次分别于术后1d、5d、9d进行注射。本专利技术的优点及效果：1、本专利技术小鼠腓肠肌失神经萎缩模型的建立是通过坐骨神经切除术建立的，而失神经肌肉萎缩模型可以不破坏萎缩部位的肌肉形态，能更好地观察miRNAs的作用。2、本专利技术通过构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型，进一步研究miR-143在体内对小鼠失神经肌肉萎缩的影响，并最终通过实验研究证明利用混有10nmolmiR-143抑制剂的100μlOpti-MEM培养基进行失神经腓肠肌部位注射可以有效延缓小鼠失神经支配肌肉萎缩过程。3、本专利技术利用混有10nmolmiR-143抑制剂的100μlOpti-MEM培养基，并分3次在术后1d、5d、9d进行失神经腓肠肌部位注射。10nmolmiR-143抑制剂为经过实验摸索筛选出的可有效发挥作用的抑制剂的量；在不同时间点分三次注射的方法可以有效减缓miR-143抑制剂注射对小鼠的刺激，并同时有助于在失神经部位维持较为稳定的miR-143抑制剂浓度。4、利用本专利技术建立的通过抑制miR-143表达来延缓小鼠失神经支配肌肉萎缩过程的方法，可以有效地延缓失神经肌肉萎缩过程，借助此方法可以为失神经肌肉损伤修复中miRNAs的利用提供一定的借鉴，并为失神经肌萎缩机制及其临床诊治的深入研究提供新的思路和参考。附图说明图1是失神经小鼠模型腓肠肌miR-143表达及相关指标检测结果图片；图2是miR-143模拟物和miR-143抑制剂注射对失神经小鼠模型腓肠肌的影响结果图片。具体实施方式下面结合具体实施方案对本专利技术进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本专利技术的保护范围。本专利技术的设计思路是：构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型，通过在肌萎缩部位注射microRNA-143(miR-143)抑制剂，从而延缓失神经肌肉萎缩过程。首先通过对小鼠进行坐骨神经切断术，构建小鼠腓肠肌失神经萎缩模型，通过实时定量PCR检测miR-143的表达量，比较腓肠肌肌肉湿重和肌纤维直径，然后在肌萎缩部位注射10nmolmiR-143抑制剂，显著降低了小鼠腓肠肌中miR-143的表达量，注射miR-143抑制剂后小鼠失神经腓肠肌组织肌纤维的直径明显高于对照组，本专利技术提供一种通过抑制miR-143表达来延缓小鼠失神经本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用miR‑143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法，其特征在于方法包括：在小鼠切除坐骨神经后的后肢腓肠肌内注射混有10nmol miR‑143抑制剂的100μl Opti‑MEM培养基，注射在小鼠失神经术后分多次进行。

【技术特征摘要】
1.一种利用miR-143抑制剂延缓小鼠失神经后肌肉萎缩的方法，其特征在于方法包括：在小鼠切除坐骨神经后的后肢腓肠肌内注射混有10nmolmiR-143抑制剂的100μlOpti-MEM培养基，注射在小鼠失神经...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁向彬，王轶敏，刘新峰，张蔚然，李新，张林林，郭宏，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12