建立克服基因功能冗余的全基因组功能缺失筛选方法技术

目前，全基因组范围内的功能缺失高通量筛选已普遍应用于各个生物过程中基因功能的研究。然而，普遍存在的基因功能冗余现象对于全面深入研究基因功能造成了很大的干扰。为此，本发明专利技术人基于基因家族建立了siRNA组合文库，该基因家族siRNA组合文库对功能相似基因的表达同时进行干扰。以检测Wnt3a诱导的β‑catenin蛋白质的稳定性为出发点，证明了相比于常规的单基因siRNA文库，基于基因家族siRNA组合文库的筛选能克服同一家族基因间的代偿效应所引起的假阴性现象。

Establishment of a genome-wide functional deletion screening method to overcome functional redundancy in genes

At present, functional deletion and high throughput screening in the whole genome have been widely used in the study of gene function in various biological processes. However, the ubiquitous redundancy of gene function causes great disturbances in the overall and thorough study of gene function. To this end, the inventors established a siRNA combinatorial library based on the gene family, and the siRNA family library of the gene family interfered with the expression of functional similar genes simultaneously. The stability of beta catenin protein to detect induced by Wnt3a as a starting point, proved that compared to the conventional single gene siRNA library, the phenomenon of false negative screening of siRNA gene family of combinatorial libraries can overcome the compensatory effects between genes in the same family caused based on.

【技术实现步骤摘要】
建立克服基因功能冗余的全基因组功能缺失筛选方法
本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及建立克服基因功能冗余的全基因组功能缺失筛选方法及其应用。
技术介绍
探索基因及其表达蛋白质在各种生理和病理过程中的作用是生命科学领域中永恒的研究主题，而高通量的功能缺失筛选成为了最强有力的研究工具之一。随着科学技术的发展，功能缺失筛选从早期的基于诱导DNA突变的筛选进入到最近10几年来兴起的大规模全基因组RNA干扰筛选时代。RNA干扰技术原理是利用小RNA片段靶向目的基因序列而沉默基因表达的[1]。目前RNA干扰(RNAinterference,RNAi)文库被广泛应用于功能缺失型基因筛选[2-4]。这种文库主要分为siRNA和shRNA两类,二者的原理都是通过RNA干扰降低目的基因的表达来引起表型改变。siRNA为人工合成的短RNA片段,能在微孔培养板中进行彼此独立的表型筛选,配合高通量液体工作站等自动化机器，能稳定快速简便地获取目标信号或者图像等表型信息,因而被广泛应用。shRNA则是通过构建到慢病毒等表达载体上，通过病毒侵染方式进行混合型文库筛选,再通过微阵列芯片或者深度测序技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建靶向基因家族的组合siRNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供一蛋白组群；(2)根据所述蛋白组群中的各蛋白序列信息，进行基于结构域的多序列比对，把具有相同结构域的蛋白归为一类，形成蛋白超家族；(3)对所述蛋白超家族中蛋白种类＞n的蛋白超家族进行拆分获得蛋白家族；对所述蛋白超家族中蛋白种类≤n的蛋白超家族不进行拆分，直接归类为蛋白家族；从而实现各蛋白家族中家族成员数均≤n；(4)提供针对各蛋白家族中各成员的siRNA，将针对同一蛋白家族中各成员的siRNA组成siRNA集，针对不同蛋白家族的siRNA集构成了所述靶向基因家族的组合siRNA文库；其中n为2、3、4、或5...

【技术特征摘要】
1.一种构建靶向基因家族的组合siRNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供一蛋白组群；(2)根据所述蛋白组群中的各蛋白序列信息，进行基于结构域的多序列比对，把具有相同结构域的蛋白归为一类，形成蛋白超家族；(3)对所述蛋白超家族中蛋白种类＞n的蛋白超家族进行拆分获得蛋白家族；对所述蛋白超家族中蛋白种类≤n的蛋白超家族不进行拆分，直接归类为蛋白家族；从而实现各蛋白家族中家族成员数均≤n；(4)提供针对各蛋白家族中各成员的siRNA，将针对同一蛋白家族中各成员的siRNA组成siRNA集，针对不同蛋白家族的siRNA集构成了所述靶向基因家族的组合siRNA文库；其中n为2、3、4、或5。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白组群包括≥200种蛋白，优选地≥500种蛋白，优选地≥1000种蛋白，优选地≥2000种蛋白，优选地≥5000种蛋白。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对于包含多个结构域的蛋白，经基于结构域的多序列比对后，根据比对结果的统计显著性(e-value)，留取统计显著性最小的结构域，把具有相同的所述统计显著性最小的结构域的蛋白归类到一起，形成所述蛋白超家族。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对所述蛋白超家族中蛋白种类＞n的蛋白超家族进行拆分获得蛋白家族的具体步骤包括：(a)对蛋白质超家族中的各个蛋白进行多重序列比对；(b)根据步骤(a)的比对结果构建系统发育树；(c)基于所述系统发育树反应出的序列远近关系，将系统树拆分为蛋白家族，每个蛋白家族的成员数≤n。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中，使用标号算法将系统树拆分为较小的蛋白家族，具体步骤包括：1)初始化标号：对系统树的每个节点，用group标号标记该节点已归类入的蛋白家族号；将初始所有节点的group标号均设为0；2)叶节点标号：遍历每个叶节点，如果该叶节点已经归类，则跳过；如果该叶节点还未归类，则取得该叶节点的直接祖先节点；根据直接祖先节点的另一个子节点是否是叶节点，又分为两种情况:2.1)如果该直接祖先节点的另一个子节点也是一个叶节点，则将这两个叶节点归到一个蛋白家族(首先归类的两个成员)，将他们和直接祖先的group设置为同一个家族号，例如为a；同时，如果该直接祖先不是根节点则取得它的更上一级祖先节点，如果该祖先节点还有一个直接叶节点，则将该叶节点作为第三个成员归入，将它和二级祖先节点的group也设置为a。2.2)如果该直接祖先节点的另一个子节点是一个中间节点且该中间节点还未归类，则跳过；如果该直接祖先节点的另一个子节点是一个中间节点且该中间节点已经归类，则只将这一个叶节点作为第一个成员，把它和直接祖先节点的group设置为同一个家族号，例如为b；同时如果该祖先节...

【专利技术属性】
技术研发人员：李林，毛丽，吴殿青，李亦学，王振，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31